蝴蝶兰叶斑病病原真菌的分离与鉴定

崔亚华,余知和 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025)

蝴蝶兰 (Phalaenopsisamabilis)为兰科 (Orchidaceae)蝴蝶兰属植物,因花形似蝶而得名,大多数分布于热带地区,如中国台湾和东南亚的泰国、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚等地,已发现有70个原生种,其中我国原产6个[1]。蝴蝶兰株型优美、花色丰富、色彩绚丽、花姿优雅,素有 “兰中皇后”之美誉,具有极高的观赏价值和经济价值[2,3]。近年来,随着栽培面积及栽培区域的扩大,蝴蝶兰病害也随之大量发生。一些真菌或细菌性病害,因传播速度快、潜伏期长等特征,常导致全株枯萎或死亡,失去观赏价值,严重影响蝴蝶兰工厂化生产,造成巨大经济损失[4]。目前已报道的蝴蝶兰常见真菌病害有炭疽病、白绢病、疫病、灰霉病、叶斑病等[5～7]。

笔者在蝴蝶兰叶片上发现的病害症状初期为淡橙黄色、近圆形小斑,逐渐扩大成不规则的黑褐色病斑,边缘模糊,后期叶片迅速失水黄化、枯萎,最后叶片断裂、脱落至整株死亡。为了明确该病害的病原,并为有效防治该病害提供依据,笔者对其病原菌进行了分离与鉴定工作。

1 材料与方法

1.1 材料

供试蝴蝶兰病株采自湖北省荆门市荆门福农生物科技有限公司蝴蝶兰生产基地,苗龄为100～120 d。分离获得的真菌菌株保藏于长江大学生命科学学院微生物学实验室。

1.2 病原菌分离

剪取蝴蝶兰叶片病健交界处,用自来水冲洗干净,再用吸水纸吸干组织表面水分,用75%乙醇处理20～30 s,无菌水冲洗3次,2%次氯酸钠浸泡3 min,无菌水冲洗5次,然后将叶片切成长度约5 mm的小方片置于PDA平板上 (培养皿直径9 cm),每皿5小片,3个重复,25℃恒温暗培养。为抑制细菌生长,配制PDA时在灭菌前每升培养基中加入2 mL氯霉素[8]。待组织块周围长出菌丝,挑取菌丝边缘菌块,经多次转接获得纯培养物,PDA斜面4℃冰箱保存备用。

1.3 分离菌株形态特征观察

纯化菌株接种于PDA平板上,25℃恒温培养,记录菌株生长速度,观察菌落特征,挑取菌丝经乳酸石碳酸棉兰染液染色制片后在显微镜下观察菌丝体形态特征。

1.4 基因组DNA提取及ITS序列测定

将纯化菌株接种至PDA液体培养基中,25℃恒温振荡培养4～6 d,收集菌丝体。按CTAB法提取基因组DNA[9],用1%琼脂糖凝胶检测DNA样品的质量和浓度。选择真菌核糖体rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCT TAT TGATATGC-3'),利用Applied Biosystems 2 720 Thermal Cycler(美国ABI公司)扩增5.8S rDNA及其两侧ITS1和ITS2基因片段。反应体系为25 μ L,其组分为:10×PCR 缓冲液2.5 μ L,10 μ m 引物1.25 μ L,10 mmol/L dNTP 0.5 μ L,2 U/μ L TaqDNA 聚合酶0.5 μ L(试剂均为鼎国公司产品), 模板 DNA 2 μ L, 双蒸水17 μ L。扩增程序为:94℃预变性2 min,35个循环,94℃变性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物工程技术服务 (武汉)有限公司进行纯化及双向测序。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及其培养性状

蝴蝶兰叶片病斑经常规组织分离得到5个菌株,分别编号为 Pa1、Pa2、Pa3、Pa4、Pa5,具体分离结果见表1。

表1 蝴蝶兰病原真菌分离结果

菌株Pa1～Pa4在PDA培养基上25℃培养,约7 d长满9 cm平皿,菌落白色,气生菌丝较发达,呈絮状,菌丝分枝状,有分隔。

菌株Pa5在PDA培养基上25℃培养,生长缓慢,7 d菌落直径约2 cm,墨绿色,菌丝致密,呈绒状,菌丝细长,较少分枝。Pa1～Pa4的菌落培养特征基本一致,而Pa5与上述4个菌株有显著不同,因此初步将其划分为2个分类单元。

2.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

为进一步确定所得病原菌的分类地位,选取2个代表菌株Pa1、Pa5对其rDNA-ITS序列进行分析。测序结果表明,菌株 Pa1、Pa5 ITS序列长度分别为565 bp和634 bp(GenBank登录号依次为JF436948,JF436949),经BLAST[10]分析,Pa1的ITS序列与腐皮镰刀菌 (Fusarium solani)近500个菌株的同源性高,E值为0.0,其中,与腐皮镰刀菌分离物F.S.0613 ITS区段 (gb|HM064429.1|)的Identities=561/563(99%),Score值为1 100 bits(555)。

Pa5的ITS序列与瓶霉菌属 (Phialophora sp.)的3个菌株的同源性高,E值为0.0,其中,与尖孢瓶霉菌 (Phialophora oxyspora)ITS区段 (dbj|AB190870.1|)Score=1 207 bits(609),Identities=616/617(99%),Gaps=1/617(0%)。

基于Landeweert等[11]对真菌分子鉴定,综合形态观察和序列数据分析结果,将菌株Pa1鉴定为腐皮镰刀菌,Pa5初步鉴定为瓶霉菌。

3 讨论

本研究从湖北荆门福农生物科技有限公司蝴蝶兰生产基地的蝴蝶兰叶片病斑部位分离到5株真菌,形态特征观察及rDNA-ITS序列分析结果表明,这5个菌株为2个分类单元,其中1个鉴定为腐皮镰刀菌。

腐皮镰刀菌是一类分布广泛的土传病原菌,可侵染多种植物 (粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物),引起植物的根腐、茎腐等病害。康峰等[12]采用形态学观察和分子鉴定方法对新疆甜瓜根腐病病原菌进行研究,确定病原菌为腐皮镰刀菌。林兰稳等[13]经显微镜直接检查、病原菌分离培养观察、致病性测定及田间病害调查,初步确定广东鹤山粉葛根腐病是由腐皮镰刀菌侵染引起的。周亚丽等[14]曾报道腐皮镰刀菌是引致长春地区蝴蝶兰根腐病的致病菌。本研究的腐皮镰刀菌分离于蝴蝶兰叶片部位,其根部并未表现出真菌病害的特征,两者不同的侵染机制还有待深入研究。

据Lopez等[15]报道,尖孢瓶霉菌是引起马足分支菌病的病原菌。而本研究还从蝴蝶兰叶片病斑部位分离到1株与尖孢瓶霉菌亲缘关系十分近的真菌,因未按照科赫法则进行致病性测定,故该菌株是否为蝴蝶兰病害的病原菌,或者是否与腐皮镰刀菌存在复合侵染,均有待于进一步研究。

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