三氧化二砷对人恶性黑色素瘤 A375细胞增殖及新癌基因 PPO表达的影响

张国强 刘思源 耿春杰 王正想 高顺强 左连富

(河北医科大学第四医院皮肤科,河北 石家庄 050011)

恶性黑色素瘤(MM)是一种黑色素细胞恶性肿瘤,平均发病年龄为 45岁,50岁以后随年龄增长而增高。外科手术仍是治疗的首选方法,但手术预后较差,达卡巴嗪和顺铂等化疗效果亦不佳〔1〕,有效率低于 25%,寻求更为有效的药物进行系统治疗具有重要意义。三氧化二砷(As2O3)在治疗急性早幼粒细胞白血病方面取得成功以后,人们开始研究其抗癌机制,发现As2O3可能通过诱导细胞分化与凋亡、阻滞细胞周期、抗肿瘤血管生成及调节多种基因表达而发挥其抗肿瘤作用〔2,3〕。最近的研究表明 As2O3可通过抑制核转录因子(NF-κB)P65核蛋白和 C-IAP2基因的表达诱导黑色素瘤细胞凋亡〔4〕。As2O3诱导黑色素细胞凋亡是否还存在其他传导通路,是否上调或下调其他基因而发挥作用值得进一步研究。多西芬氧化酶(PPO)基因是一个新癌基因,研究显示该基因在 MM组织中存在过表达,与细胞增殖关系密切〔5〕。国内外尚无研究 PPO基因在黑素瘤(A375)细胞株表达情况的报告。本研究以体外培养的A 375细胞为研究对象,观察 As2O3对 A 375细胞生长的影响,研究 PPO基因在A375中的表达情况,探讨该药对人A375细胞癌基因PPO表达的影响,以期为MM的临床治疗提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人恶性MM细胞株 A375(购自北京中科院科研中心);免疫细胞化学试剂 PPO多克隆抗体(鼠抗 PPO IgG)武汉晶赛生物制剂公司生产;免疫细胞化学试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司;As2O3(购自哈尔滨伊达药业有限公司,国药准字 H19990191,10 ml/支,每支含 As2O310 mg);DMEM购自美国 Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。倒置相差显微镜为日本 Nikon公司,酶标仪为郑州博塞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将 A 375细胞培养于含 10%胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素 100 U/ml,含链霉素 100 U/ml,pH7.2)中,置于 37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内常规传代培养。

1.2.2 MTT比色法检测As2O3对 A375细胞的影响 取对数生长期的细胞,用加样枪铺 96孔板。培养 6 h,待细胞完全贴壁后加药。设空白对照组(内无细胞只加培养基)﹑阴性对照组(单细胞悬液不加任何药物干预)和 As2O3组,As2O3组按下列浓度分 3组(1、5、10 μmol/L),分别作用 24、48和 72 h。于培养结束前 4 h,各培养孔加入 MTT(5μg/ml)10μl,培养 4 h后,用全自动酶标仪于波长 570nm处测定各孔吸光度值,所有试验重复 3次,并根据公式计算细胞的抑制率(毒性指数,CI)。CI=(1-试验组 OD值/对照组 OD值)×100%。

1.2.3 流式细胞技术(FCM)检测细胞周期及凋亡 取同时传代至指数生长期的瓶装细胞,制备单细胞悬液,将细胞悬液分到 4个培养瓶中进行培养。12 h后,随机分为阴性对照组、As2O3(1、5、10μmol/L)组,共 4组。弃旧培养基加入药物进行干预,每瓶培养基的最终体积均为 5 ml,继续放入培养箱中培养。培养 48 h后,按顺序分别收集各组的培养液。将细胞悬液按照一一对应的关系吸入相应离心管中,离心。离心完毕后去上清液,缓慢加入 4℃、70%的冷乙醇 2～3 ml,4℃冰箱中固定24 h。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞,离心,1 000r/min,4 min,离心完毕后弃上清液。加入 1 ml碘化丙啶(PI)染液一步插入法进行 DNA染色,0～4℃保存 30 min,500目铜网过滤后上机测定。

1.2.4 倒置相差显微镜观察各组药物处理后对人A 375细胞的细胞分化及形态的影响 取同时传代至指数生长期的瓶装细胞,接种于铺有盖玻片的 6孔板中,放入温箱中培养。培养12 h待细胞贴壁后,随机分为阴性对照组、As2O3(1、5、10μmol/L)组,共 4组。加入药物进行干预,阴性对照组加入含 10%胎牛血清的DMEM培养基,每孔培养基的最终体积均为3 ml,继续放入 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。培养 48 h后固定,在固定细胞的过程中,将 6孔板放在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.5 免疫细胞化学法检测PPO蛋白的表达 免疫组化法(SP)染色。PPO结果判定:阴性(-):胞浆无棕色颗粒着染者,细胞不着色;阳性(+):细胞质可见少许棕色颗粒,细胞呈红色;强阳性(⧺):在多数的细胞胞浆内见有明显棕色颗粒着染,细胞呈深红色。每张爬片于高倍镜下随机观察 5个视野,计算阳性细胞占计数细胞总数的百分比。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行处理,计量资料以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用 LSD-t检验;计数资料采用百分比表示,比较进行χ2检验。

2 结 果

2.1 As2O3对人 MM细胞 A 375增殖抑制的影响 MTT法测定结果显示,与阴性对照组相比,As2O3在 1～10μmol/L浓度范围内对 A375细胞有明显的增殖抑制作用,呈现明显的剂量和时间依赖效应关系。统计分析表明,在 24、48、72h三个时间段内,As2O3对人A375细胞的抑制作用随着浓度的增加而增加,且以 10μmol/L浓度组作用 72 h的抑制率最高。As2O3作用 24h后,1、5、10μmol/L浓度组对 A 375细胞的抑制率分别为 4.60%、43.20%、56.29%;As2O3作 用 48 h后,1、5、10μmol/L浓度组对 A 375细胞的抑制率分别为 6.79%、46.76%、56.65%;As2O3作用 72 h后,1、5、10.0 μmol/L浓度组对 A 375细胞的抑制率分别为 57.77%、74.43%、84.58%。与对照组之间及相邻药物作用组之间的抑制率相比差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 1。

2.2 FCM检测细胞凋亡及细胞周期分布 As2O3可影响细胞的 DNA的合成,改变细胞周期和信号传导途径,使细胞在S期停滞。本研究应用低分子量 DNA抽提后 PI染色法(Sub-G1法)标记细胞,然后用 FCM进行定量检测。FCM可根据 DNA含量快速计算出细胞各期分布的百分比和凋亡率。A 375细胞经 5μmol/L As2O3作用 48 h后,处于 S、G1、G2/M各期的细胞比率分别为 68.70%、18.80%、12.50%,与对照组 22.90%、60.80%、16.30%相比差异具有显著性(P＜0.01)。FCM结果表明,As2O3能诱导A375细胞凋亡,随着时间的延长凋亡细胞数目增加。随着浓度的增加凋亡细胞数目增多。见表 2。

表1 As2 O3对 A375细胞增殖的抑制作用(%,±s)

表1 As2 O3对 A375细胞增殖的抑制作用(%,±s)

1)与对照组比较,2)与前一浓度组比较,3)与前一时间点比较:P＜0.01,下表同

对照组 1.21±0.12 0.85±019 0.49±0.07 As2 O3 1.0 4.60±0.611) 6.79±0.581)3)57.77±1.341)3)As2 O3 5.0 43.20±1.171)2)46.76±1.721)2)3)74.43±2.551)2)3)As2 O3 10.0 56.29±0.121)2)56.65±2.361)2)3)84.58±3.761)2)3)

表2 As2 O3对 A 375细胞周期及凋亡率的影响(%,±s)

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2.3 倒置显微镜观察细胞形态变化 阴性对照组细胞贴壁良好,呈梭形或多角形,可见伪足,大小一致,胞膜完整,光滑,有光泽,胞体狭长,透亮,胞浆饱满﹑均匀,折光性好,中央有圆形或椭圆形的胞核,细胞增殖快速。经 As2O3作用后,可观察到部分细胞双极性改变,另有细胞的形态发生了明显改变,细胞散在分布,细胞明显皱缩﹑破裂,伪足消失,失去原有形态,折光性减弱,细胞生长缓慢,随着作用的时间延长,细胞数目较对照组明显减少,越来越多的细胞漂浮在培养液中,未脱壁细胞双极性改变相对增多。

2.4 SP法检测As2O3对 A375细胞中 PPO蛋白表达的影响阴性对照组 A375细胞免疫细胞化学染色后PPO表达明显,表现为胞浆大量棕色颗粒。分别经 1、5、10μmol/L As2O3作用48 h后,PPO的表达均有减弱,且 10μmol/L As2O3作用时表达减弱更明显,其细胞质和细胞膜仅有浅棕色着色。见表 3,图1。

表3 As2O 3对 A 375细胞 PPO蛋白表达的影响〔n(%)〕

图1 As2 O3对 A 375细胞 PPO蛋白表达的影响(×400)

3 讨 论

MM是一类恶性程度很高的黑色素细胞肿瘤,多发生于皮肤,化疗效果很差〔6〕。直到现在各种免疫治疗的疗效仍不理想〔7〕,国内外学者仍在探索更加安全有效的治疗方法和药物。As2O3能诱导多种肿瘤细胞凋亡,其机制主要有:改变线粒体膜通透性,调节凋亡相关基因表达,改变细胞内氧化还原状态,抑制端粒酶的活性和影响细胞周期等〔8,9〕。陈治文等发现 As2O3也可诱导黑色素瘤细胞凋亡〔4〕。As2O3诱导MM细胞凋亡的机制及诱导效果值得深入研究。

MTT分析发现,As2O3抑制 A375细胞增殖,并且在一定范围内有剂量依赖性。随着作用时间的延长,对A 375细胞的增殖抑制和凋亡作用随之逐渐增强,表现出一定的时间依赖性。FCM检测了 As2O3作用A375细胞48 h后细胞凋亡率,试验结果显示:As2O3组监测到明显的细胞凋亡峰。与MTT比色法测定的肿瘤细胞抑制率相吻合,进一步表明在诱导肿瘤细胞分化的同时亦抑制其增殖。随着药物浓度的增加,S期的比例显著增加,出现 S期阻滞,提示 As2O3将 A375细胞阻滞在 S期可能是其增殖抑制的原因之一。倒置相差显微镜主要是利用光在通过不同物质时的折光和物体厚度差别,产生衍射而引起光程变化,光程的变化又引起相位差的变化来观察物体结构,是观察细胞形态最基本的方法之一。在As2O3诱导A375细胞的过程中,动态观察细胞形态变化时发现:贴壁细胞不断脱落,细胞形态呈双极性改变,趋向良性分化,培养液中悬浮细胞逐渐增多。可见,As2O3可抑制A375细胞分裂生长,改变细胞增殖动力学,降低皮肤黑色素瘤细胞株的恶性程度。

As2O3诱导A375细胞凋亡、抑制增殖可能是通过下调某些相关癌基因和某些生长有关的细胞因子的表达来实现的〔4,9〕。PPO基因是 2007年筛选发现并克隆出的一个新的癌基因,定位于人类 1号染色体末端 1p36.13区,DNA长度约36 000 bp,cDNA长度 6 022 bp,共有 25个外显子,编码 993个氨基酸〔10～12〕。既往研究显示该基因在 MM组织有过表达〔5〕。本研究发现在 A375细胞中 PPO蛋白同样存在过表达。进一步证实 PPO基因在 MM发生发展过程中起作用,为深入研究MM的病因提供了帮助。As2O3对 MM细胞的诱导分化作用,是否通过对PPO基因的抑制而起作用?采用SP法检测前后癌基因 PPO的表达,发现As2O3作用后的 A375细胞 PPO蛋白的表达明显减弱,本文认为 As2O3对人 A375细胞的作用可能与下调癌基因 PPO的表达有关,可能是通过下调PPO的表达,阻断丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路下游的 MEK 1/2和 ERK 2磷酸化来实现的,从一个新的角度探讨了As2O3的抗肿瘤作用。为今后通过沉默 PPO基因以实现对MM A 375细胞周期和凋亡的影响提供了实验依据。

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