饲用β-葡聚糖酶的发酵工艺研究

2011-03-09 12:33刘德海王红云徐文涛陈小鸽

饲料工业 2011年8期

刘德海王红云徐文涛陈小鸽

1975年，美国饲料业首次在大麦饲料中添加β-葡聚糖酶，并取得了显著效果，从而引起世界各国重视。现在欧洲等国家通过使用葡聚糖酶制剂已使大麦等能量饲料在饲料中用量达70%。近年来，随着我国畜禽饲料生产的规模化、现代化，玉米已经远远不能满足饲料生产的需要，每年要进口大量玉米以满足需要[1]。因此，大麦、小麦、燕麦等麦类作物在饲料中的用量不断增加，但这些谷类作物中抗营养因子β-葡聚糖含量较高[2]，难以被单胃动物（猪和禽）吸收，导致营养物质消化率低下，饲养效果差，从而限制了麦类作物及其副产品在饲料中的应用。利用β-葡聚糖酶降解β-葡聚糖，消除其抗营养因子作用，从而提高饲料利用率[3-4]，开发麦类能量饲料新资源，已成为饲料工业研究热点之一。随着微生物发酵技术（包括菌种选育和发酵设备）的快速发展，饲用β－葡聚糖酶制剂得到了研究应用。葡聚糖酶的应用，使大麦代替玉米-豆粕型饲料中的部分玉米成为可能，因而具有良好的发展前景。

本研究拟在通过对本实验室保藏的12株黑曲霉菌株采用培养、选择性培养基分离，筛选出一株相对酶活较高的菌株作为出发菌株，然后通过紫外线、化学诱变剂等物理化学诱变方法处理诱变筛选出一株β－葡聚糖酶高产菌株，并对其固态发酵工艺条件进行研究，为β－葡聚糖酶的工业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 出发菌株

12株黑曲霉菌株，由本实验室保藏。

1.2 培养基

1.2.1 察氏培养基

NaNO33.0 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g 、蔗糖 20.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1000 ml，pH 值 6.7。

1.2.2 筛选培养基

0.2 %酵母膏、0.2%（NH4）2SO4，0.01%MgSO4·7H2O、0.05%KH2PO4、1%β－葡聚糖、2%琼脂、0.005%刚果红，pH值自然。

1.2.3 发酵培养基

麸皮70 g、豆粕粉10 g、花生壳粉15 g、大麦粉5 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、NaNO31 g、水 100 ml。

以上培养基灭菌条件：0.1 MPa，30 min。

1.3 主要分析仪器

分光光度计（北京普析T6新世纪），电子天平（TD200A，常熟），数显电热培养箱（303A-2）,紫外灯，万能显微镜（AHB-CB-1，日本）。

1.4 主要试剂

底物β－葡聚糖购自Sigma公司，其余药品及试剂均为国产分析纯。

1.5 菌株分离方法

1.5.1 菌种的诱变方法[5]

从12株黑曲霉保藏菌株中，初筛出产β－葡聚糖酶活较高的菌株，采用物理诱变与化学诱变相结合交替诱变的方法对其进行诱变，先采用紫外线诱变，后采用硫酸二乙酯DES诱变，再采用紫外线进行诱变，提高其酶活力，得到高活力产酶菌株。

菌株分离诱变程序：

出发菌株→制备孢子悬液→紫外线诱变处理→硫酸二乙酯DES诱变处理→紫外线诱变处理→初筛→复筛→发酵性能测定→生产菌株

1.5.1.1 紫外诱变

用适量无菌水洗下活化后的新鲜经初筛斜面黑曲霉菌株孢子，倒入已装有玻璃珠的灭菌三角瓶中摇床上震荡约0.5 h，使孢子充分分散。用无菌滤纸过滤除去菌丝，制成孢子悬液，调整孢子浓度至106个/ml，在25 W紫外灯下距离25 cm处进行紫外线照射，照射时间分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min。于红灯下稀释涂布于筛选培养基平板，30℃恒温培养箱中避光倒置培养3～4 d备用。

1.5.1.2 化学诱变

选取上述紫外诱变水解圈明显，挑取直径比最大的菌落于菌管中培养，进行进一步的硫酸二乙酯DES化学诱变筛选。将诱变菌株斜面菌管用0.1 mol/l磷酸钾缓冲液（pH值7.0）洗下孢子数次，制成浓度为108个/ml菌悬液。取10 ml菌悬液至一无菌碘量瓶内，加入95%酒精数滴和0.1 ml硫酸二乙酯（最终体积分数为1%），震荡处理30 min，加入25%硫代硫酸钠溶液终止反应，震荡10 min后用磷酸钾缓冲液离心洗涤3次，吸取0.1 ml涂布于筛选分离培养基平板。

1.5.2 初筛

诱变后试管斜面菌用无菌水制成菌悬液，再分别稀释至10-6和10-7，吸取0.1 ml分别涂布于筛选培养基平板上，28～30℃培养3～4 d。观察生长的单菌落周围产生的透明圈大小来初步判断菌株产β－葡聚糖酶活力能力。

1.5.3 复筛

从初筛平板中选取菌株周围透明圈较大的单菌落转接试管保藏培养基中培养，然后接入固体发酵培养基进行复筛。将突变菌株孢子挑2～3环挑取接入培养基中，每500 ml三角瓶装入50 g固体培养基（湿基），28～30℃培养36 h，进行酶活力检测，以筛选出酶活力最高的菌株。

1.6 分析方法

水分按QB/T6435饲料水分的测定方法；铅砷按QB/T13079饲料中卫生指标的测定方法。

β－葡聚糖酶酶活力测定方法采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。

取经50℃水浴中预热2～3 min的0.7% β－葡聚糖溶液（pH值5.0柠檬酸缓冲液配制）2.0 ml，加入适当稀释的酶液0.5 ml，50℃保温反应30 min，加入3,5-二硝基水杨酸2.5 ml，具塞，沸水浴加热5 min，冷却，530 nm波长下测定OD值。在此条件下，每分钟产生相当于1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。

1.7 生产工艺流程

1.8 发酵条件

斜面菌种培养（29+1）℃，培养3～4 d；扩大种子培养基（29+1）℃，培养3～4 d；固体发酵培养（29+1）℃，培养37～38 h。

1.9 后处理

低温烘干，温度不得超过50℃。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的诱变筛选

初筛产生的出发菌株An08经紫外线照射与硫酸二乙酯DES的交替处理，最终获得一株突变株An08-752，β－葡聚糖酶酶活力提高了213%。其诱变顺序如下：

2.2 固态发酵培养基的筛选

2.2.1 碳源对酶活力的影响

以玉米粉、大麦粉、麸皮、米糠、花生壳粉、玉米秸秆粉、复合碳源（麸皮+花生壳粉+大麦粉）为供试碳源进行固态发酵试验，测定β－葡聚糖酶酶活力，找出最佳产酶培养基，测定结果如表1所示。

表1 不同碳源对酶活力的影响（U/g）

由表1可以看出，以复合碳源（麸皮+花生壳粉+大麦粉）7号为最佳，其次是麸皮3号、大麦粉2号、花生壳粉5号、米糠4号等为碳源培养基时，其β－葡聚糖酶酶活力较高，玉米秸秆粉6号为碳源培养基时酶活力最差。大麦粉对酶活诱导能力与麸皮比较优势不明显。考虑到发酵成本等因素，确定麸皮、花生壳粉、大麦粉复合碳源为选择碳源。

2.2.2 氮源对发酵产酶的影响

以最佳碳源即复合碳源（麸皮+花生壳粉+大麦粉）7号为基本培养基，添加适量的有机氮源酵母粉、豆粕粉；无机氮源硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵为供试氮源进行固态发酵试验，测定其产酶活力，分析结果如表2所示。

表2 不同氮源对酶活力的影响（U/g）

由表2可以看出，在有机氮源中，以豆粕粉为氮源得到的葡聚糖酶酶活力最高；无机氮源中，以硫酸铵为氮源得到的酶活力较高，硝酸钠次之，硝酸铵为氮源时酶活力最低。有机氮源得到的酶活要比无机氮源得到的酶活要高。确定有机氮源为豆粕粉，无机氮源为硫酸铵、硝酸钠。

2.2.3 无机盐金属离子对酶活力的影响

在以复合碳源（麸皮+花生壳粉+大麦粉）为碳源、有机氮源为豆粕粉、无机氮源为硫酸铵、硝酸钠的培养基上，分别添加无机磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸亚铁，进行固态发酵培养试验后，测定β－葡聚糖酶酶活力，观察无机盐金属离子K+、Mg2+、Na+、Fe2+对β－葡聚糖酶酶活力的影响，结果见表3。

表3 无机盐金属离子对酶活力的影响（U/g）

由表3可以看出，添加无机盐磷酸氢二钾K+、硫酸镁（Mg2+）对产β－葡聚糖酶有一定的促进作用，磷酸二氢钠（Na+）、硫酸亚铁（Fe2+）对产 β－葡聚糖酶没有促进作用。

2.2.4 培养基含水量对发酵产酶的影响

固态发酵工艺产酶过程中，发酵培养基基质含水量至关重要，水量过大会造成培养基发黏，透气性差，黑曲霉生长发酵氧气供应不足，易引起细菌的污染；加水量过小则不能满足菌株生长对水分的需求。发酵培养基加水量见图1。水分添加量以料水比为1：1为最佳。

图1 水分对β－葡聚糖酶酶活力的影响

2.3 发酵产酶培养条件的研究

2.3.1 初始pH值对发酵产酶的影响

pH值是影响菌株生长的一个重要因素，对代谢的酶活性有调节作用。以基本培养基为基础，将发酵培养基用水调 pH 值为 6.0、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5，每个三角瓶加水量一致，发酵完成后测定β－葡聚糖酶酶活力，其比较结果见图2。当pH值接近6.8时，产β－葡聚糖酶酶活力较高，说明该菌株适合在微酸性环境中发酵生长。

图2 初始pH值对β－葡聚糖酶酶活力的影响

2.3.2 培养温度对发酵产酶的影响

温度是影响菌株生长产酶活性的一个重要因素，本试验设计了25℃、27℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃计7个梯度的温度进行试验，产酶活力的影响见图3。可以看出，在30℃发酵培养时产酶活力较高。高于或低于该温度时，酶活力都有所下降。

图3 发酵温度对β－葡聚糖酶酶活力的影响

2.3.3 装料量对发酵产酶的影响

曲霉菌为好气性微生物，在生长发酵产酶过程中需要一定的氧气以维持其代谢和代谢产物酶的合成。三角瓶装料量多，培养料间氧气不足，造成代谢异常，酶产量低；装料量少，随着发酵温度的升高，水分挥发引起培养料含水量下降，产酶代谢低。本试验对500 ml三角瓶装量（湿基）25 g、40 g、45 g、50 g、55 g、60 g 分别做了发酵对比，其结果见图4。从图4结果可以看出，500 ml三角瓶装料量为50 g/500 ml时，其产酶活力最高。