康氏木霉固态发酵产纤维素酶室温条件的研究

李明轩 齐雪 赵雪 旦周松毛 张敏

纤维素类物质是地球上最丰富的资源，每年约生成1500～2000亿吨，其中除部分被作为造纸和植物纤维利用外，大部分被燃烧和废弃[1]。这不仅仅是资源的浪费，对环境也造成巨大的危害。如何更好地利用纤维素开发新能源，减少对环境污染等工作就变得尤为重要。通过微生物发酵秸秆产纤维素酶添加剂，提高饲料利用率，节约能源，减少对环境污染具有现实意义。

纤维素酶作为饲料添加剂在畜禽生产中应用广泛。目前，应用最多的就是以秸秆为原料固体发酵产纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，参与纤维素降解的多组分酶的总称，也是一个完整的纤维素酶系。利用微生物所产生的纤维素酶将秸秆转化为营养价值较高的单细胞蛋白饲料[2]，既改变传统的农业生产方法，又为开发新饲料原料的发酵工业原料奠定基础；同时还可将废弃物变成能源，消除公害，保护环境，这也是国内外饲料业研究的热门。本试验是在室温条件下筛选出康氏木霉固态发酵最优条件，为探讨大型康氏木霉固态发酵最佳工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

康氏木霉由本实验室提供，保存于PDA斜面培养基；稻草秸秆粉（当地农户提供，粉碎40目筛）；麸皮（市售）。

1.1.2 主要试剂

DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸显色液）；1%乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH值4.8）；1%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液（1 g CMC以pH值4.8醋酸缓冲液定容100 ml）。

1.1.3 培养基PDA

去皮马铃薯 200g、蔗糖 20g、琼脂 15g、水 1000ml，121℃高压蒸汽灭菌30 min。

固体发酵培养基为70%稻草、30%麸皮、3%尿素；营养液为 0.3%KH2PO4、0.06%CaCl2、0.05%MgSO4、Fe－SO4·7H2O 0.0005% 、CoCl20.0002% 、ZnSO4·7H2O 0.0007%、MnSO4·H2O 0.00016%。

1.2 方法

1.2.1 产酶固体发酵

将保藏的康氏木霉菌种接种到PDA斜面培养基中活化培养72 h,放在4℃冰箱中保存。往试管中滴加无菌水，振荡制成种子液，将种子液接到固体发酵培养基中放到室温下，自然通风培养4 d。

1.2.2 粗酶液制备

固体曲加入20 ml蒸馏水，静提1 h，用纱布过滤，滤液离心15 min（3500 r/min），上清液即是待测酶液。

1.2.3 酶活力的测定[3]

1.2.3.1 羧甲基纤维素酶（CMC）测定

取适当稀释的酶液0.5 ml，加入1 ml质量分数为1%的CMC溶液，溶于pH值4.8的0.1 mol/l HAc—NaAc缓冲液中，50℃保温30 min，加入3 ml DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后加水稀释到25 ml，在520 nm紫外分光光度计下测还原糖含量。

1.2.3.2 滤纸酶(FPA)活力的测定

取适当稀释的酶液0.5 ml，加入1 ml、pH值4.8的0.1 mol/l HAc—NaAc缓冲液中，并加入1条1 cm×6 cm的滤纸，50℃保温1 h，加入3 ml DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后加水稀释到25 ml，在520 nm紫外分光光度计下测还原糖含量。

1.3 酶活力定义单位

1 ml酶液于50℃、pH值4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液底物产生1 μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

式中：A——OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（μg）；

D——酶粉（液）稀释倍数；

T——反应时间（min）。

2 结果与分析

2.1 不同氮源对产酶的影响（见图1）

图1 不同氮源对产酶的影响

在其它条件相同时，本试验分别用（NH4）2SO4、蛋白胨、（NH4）2SO4+尿素、尿素等做为氮源，来研究不同氮源对纤维素酶活性的影响，通过对CMC和FAP纤维素酶活力测定来检测，结果表明（见表1），在其它条件相同时，使用尿素作为氮源时，纤维素酶活性最大。这与催福绵等报道的无机氮优于有机氮的结论[4]相悖。

2.2 氮源添加量对产酶的影响（见图2

图2 不同氮源添加量对产酶的影响

由图2可知，随着尿素添加量的逐渐增加，纤维素酶活性出现不规则的变化趋势，其中添加3%尿素时结果最佳，在此之后逐渐下降，因此，3%添加量为最佳室温发酵氮源添加量。

2.3 稻草和麸皮的不同配比对产酶的影响（见图3）

图3 稻草和麸皮的不同配比对产酶的影响

由图3可知，以稻草为发酵的基准物，通过统计分析可以看出，稻草和麸皮的配比为2：8时效果较突出，其余配比对产纤维素酶影响不大，但综合考虑麸皮过多，会使基质粘稠，不利于产酶及增加原料价格，最终试验结果确定，稻草和麸皮配比以7：3最宜，既不影响产量又降低了成本。

2.4 接种量对产酶的影响（见图4）

由图4可以看出，随着接种量的增加，除2%的接种量以外，其余的纤维素酶活性变化呈下降的趋势，可能因为接种量过大时造成了菌种生长迅速，基质中生长的营养物质消耗过多，不利于产酶，因此，酶活性较低，接种量为2%时纤维素酶活性最大，确定2%为室温发酵最佳接种量。

图4 接种量对产酶的影响

2.5 含水量对产酶的影响（见图5）

图5 含水量对产酶的影响

固态发酵中，培养基内的水分含量决定着菌种生长过程中微生物对营养成分利用情况，对微生物生长和酶合成起到至关重要的作用，图5表明，含水量为150%时结果最好，确定150%的含水量为最佳的室温发酵条件。

2.6 发酵时间对产酶的影响（见图6）

由图6可以看出，培养时间为72 h，酶活性最高，从24～72 h，酶活性呈逐渐升高趋势，在72 h达到顶峰，纤维素酶活力最大。这可能是因为72 h前菌体大量增加，其分泌纤维素酶的量大大增加，酶活性逐渐增加，而从72 h以后菌体不再增加，随时间的延长菌体逐渐衰退，分泌纤维素酶逐渐减少，酶蛋白逐渐变性失活，酶活性也随之逐渐下降[5]。

图6 发酵时间对产酶的影响

2.7 培养基初始pH 值对产酶的影响（见图7）

图7 培养基初始pH值对产酶的影响

由图7可以看出，随着pH值逐渐升高，纤维素酶活力呈规则性变化，酶活性逐渐下降，其中培养基pH值在3.0时酶活性最大，可能是因为霉菌在室温环境中适宜酸性条件生长，中性或碱性环境中霉菌在室温条件下受到抑制，最终确定pH值在3.0时为最佳发酵条件。

3 讨论

3.1 添加高剂量的氮源可能会导致发酵初期菌体的生长过快，导致对氮的消耗过快，而添加较低量的氮源，因供应不足而使菌体生长繁殖过慢，以上情况都不利于室温固体发酵产纤维素酶[6]；最终选择3%添加量为最佳氮源添加量。

3.2 以稻草为发酵的基准物，本试验选用麸皮作为碳源添加,结果表明，稻草：麸皮为2：8时酶活性最高，这可能与麸皮富含多糖、蛋白质、纤维素和矿物质等常用的产酶需要的营养成分有关，生产规模过大时，麸皮含量过多，培养基粘度增大，基质透气性较差，不利于好氧的康氏木霉的发酵，影响生产规模和产量。稻草粉是很好的诱导物又含有丰富的纤维素，增加培养基的空隙，有利于产纤维素酶，且麸皮成本低，综合以上因素，稻草和麸皮配比以7：3最适宜。

3.3 不论是孢子萌发、菌丝生长或酶的形成都需要适当水分，水分过高培养基结块，氧气浓度低，发酵不彻底，水分过低无游离水，培养基干燥难以利用[7]；对菌种菌丝体生长和酶合成影响较大，当营养液用量较大时，酶的合成量也有一定程度的下降，主要因为培养基中水分过高时，灭菌后的基质凝结成团，菌种就只能在固体料的表面生长，不能很好的生长到内部，从而降低了菌种对基质的利用率，也会阻碍菌体对氧气的利用。

3.4 改变固体培养基初始pH值，在室温（温度和湿度不恒定）的条件下，培养72 h，由表7可以看出，随着pH值的升高，酶活力逐渐下降。有些资料报道[8]，pH值在6.5左右为固体培养基自然值，也是康氏木霉菌种发酵的最佳pH值。但是本试验中培养基pH值在3.0时，酶活性最大，这可能是因为在室温的条件下，霉菌比较适于偏酸的环境中生长，偏酸的环境可以改变培养基中有机化合物的离子作用程度，细胞可以更好地利用、吸收培养基中的营养物质，有利于微生物的生长；然而酸度环境也增大了细胞膜的通透性，促进纤维素酶的胞外分泌，继而大幅度地提高了纤维素酶的活性。

3.5 本试验在室温环境下（温度和湿度不恒定），筛选康氏木霉固态发酵产纤维素酶的最佳条件，目的就是将此研究应用到生产中，能在室外大规模地发酵以及推广。由以上试验分析的各种因素和试验结果适合大型发酵产纤维素酶工艺的最佳条件，为纤维素酶生产工艺的研究提供参考。

4 小结

以纤维素酶活力最大以及适应大规模生产为目的，对康氏木霉固体发酵产纤维素酶进行室温条件单因素筛选发酵最佳条件，试验结果表明，以稻草为主要碳源，麦麸又是很好的纤维素酶诱导物质，所以稻草与麦麸比为7：3时配比最合理，氮源选择尿素，3%为最佳氮源添加量，150%的含水量最适宜纤维素酶的生长，培养基的初始pH值为3，培养时间72 h时纤维素酶活性最大。由于本试验在室温条件下研究测定纤维素酶活性，可能对酶活性有影响，但反复试验得出较一致的结果，在此基础上就能为养殖场室外大发酵池发酵秸秆的研究奠定了基础，有助于大规模发酵，因此，固态发酵生产纤维素酶具有现实意义。另外，多因素条件混合菌种发酵能更好地发酵秸秆产纤维素酶，在此试验单因素条件基础下有待进一步研究。

[1]姜秋会，熊亚，刁治民.康氏木霉固态发酵纤维素酶的初步研究[J].青海草业,2004，13（1）:6-7.

[2]王仪明，张宗舟，蔺海明，等.绿色木酶固态发酵产纤维素酶活力的研究[J].草业科学,2009，26（5）:123-127.

[3]张龙翔，张庭芳，李令媛主编.生化实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社，1997.

[4]崔福绵,刘菡,韩辉，等.康宁木霉cp88329纤维素酶产生条件的研究[J].微生物学通报,1995,22(2):72-76.

[5]张建新，刘起丽，李学梅，等.康氏木霉固态发酵生产纤维素酶条件的研究[J].西北农林科技大学学报,2005,33(11):100-101.

[6]钟发刚，王新华，饲料纤维素酶研究进展[J].中国微生物学杂志，2002，14（5）：308-309.

[7]董义伟，李大平，田崇民，等.绿色木霉固态发酵降解纤维素的研究[M].四川大学，2006：13-22.

[8]靖得兵，李培军，王力华，等.康氏木霉固体发酵生产纤维素酶优化研究[J].食品工业,2004,25(5):82-85.