银杏叶提取物对白介素-1β损伤关节软骨细胞MMP-3和TIMP-1的影响

赵东杰，王 峻，何炳荣

银杏叶提取物对白介素-1β损伤关节软骨细胞MMP-3和TIMP-1的影响

赵东杰，王 峻，何炳荣

目的：观察银杏叶提取物对白介素-1β损伤的关节软骨细胞的作用及对MMP-3、TIMP-1的影响。方法：在无菌环境下消化得到3个月龄雌性新西兰白兔膝关节软骨细胞，用第2代软骨细胞。软骨细胞与IL-1β（5 μg/L）、IL-1β（5 μg/L）加地塞米松（10-6mmol/L）、IL-1β（5 μg/L）加银杏叶提取物（40 mg、80 mg、160 mg/L）共同孵育，24 h后ELISA测定受损伤软骨细胞培养液中的MMP-3及TIMP-1。结果：损伤后的软骨细胞培养液中的MMP-3增多，TIMP-1分泌较少。地塞米松同银杏叶提取物均可对抗IL-1β的效应，银杏叶提取物的这种效应有剂量依赖性。结论：银杏叶提取物通过调节受损伤后软骨细胞MMP-3和TIMP-1生成，保护IL-1β损伤的膝关节软骨细胞。

银杏叶提取物；骨关节炎；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制剂

银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，EGb）具有抗氧化、清除氧自由基、改善细胞代谢多方面作用,广泛应用于抗衰老和心脑血管疾病的治疗和保健。临床应用可改善部分老年骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者的症状。本实验选用EGb干预白介素-1β（interleukin-1，IL-1）损伤的兔膝关节软骨细胞，通过观察基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、基质金属蛋白酶抑制剂（tis-sue type inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的变化探讨其抗OA机制。

1 材料和方法

1.1 动物 雌性3个月龄新西兰白兔1只（浙江大学实验动物中心，许可证号：SYXK（浙）2007-0099号）。1.2 主要试剂及设备 DMEM培养基（美国Gibco公司）；新生牛血清（北京鼎国生物技术公司）；无钙镁磷酸缓冲液（PBS）；青霉素-链霉素液（p/s）；胰蛋白酶（Sigma公司）；II型胶原酶（Invitrogen公司）；重组大鼠白介素-1β（IL-1β，Sigma公司）；银杏叶提取物注射液（金纳多注射液，德国威玛舒培博士药厂，Ginkgo biloba Extract761，EGb761）；地塞米松磷酸钠注射液（上海通用药业股份有限公司）；噻唑蓝（MTT，Thiazolyl blue，Genview公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；考马斯亮蓝G-250(USA，Fluka公司)，兔基质金属蛋白酶-3酶联免疫试剂盒；兔基质金属蛋白酶抑制因子-1酶联免疫试剂盒(美国ADL进口分装)。

CO2恒温孵育箱（美国NAPCO公司)、超净工作台(上海净化设备厂)，IMT-2B型倒置显微镜（日本Olympus公司)、酶标比色仪（美国BIO-RAD公司)、721可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 软骨细胞的分离和培养[1]雌性3个月龄新西兰兔过量戊巴比妥钠静脉注射，处死后在半无菌条件下打开膝关节。用无菌解剖刀从关节面小心取出所用关节软骨，分别由0.25%的胰蛋白酶溶液及0.02%II型胶原酶溶液消化获得原代软骨细胞。72 h后更换培养液。当细胞长满单层的80%～100%后传代培养。以组织化学甲苯胺蓝染色法检测，培养物的细胞外基质部分若存在酸性糖胺多糖则呈异染性，呈蓝色、紫红色，据此鉴定软骨细胞的表型(见图1)。

图1 原代软骨细胞甲苯氨蓝染色鉴定，光学显微镜下细胞呈异染性（×400）

1.3.2 银杏叶提取物对白介素-1β损伤软骨细胞MMP-3及TIMP-1的影响 取生长良好第2代的软骨细胞，在培养液中配成1×105/mL浓度，接种96孔培养板中，每个培养孔100 μL，置于体积分数为5%CO2培养箱。当细胞长满单层的80%以上，弃去培养液及未贴壁的细胞。分别加入含IL-1β和药物的含血清培养基，实验时每孔加至180 μL。根据实验分组如下：⑴正常软骨细胞组，加入普通培养液。⑵IL-1β组，按浓度5 μg/L加入IL-1β。⑶IL-1β（5 μg/L）加地塞米松10-6mmol/L。⑷IL-1β（5 μg/L）加银杏叶提取物（40 mg 、80 mg、160 mg/L）。每组6个平行样本。培养24 h后吸出各组培养液按试剂盒说明方法测定MMP-3及TIMP-1含量。

2 结果

2.1 受试组软骨细胞的形态学改变 倒置相差显微镜观察下，IL-1β组软骨细胞分布松散，生长较其他组的细胞慢，部分细胞变圆、皱缩，细胞活力下降。地塞米松组细胞形态及细胞活力较IL-1β组好，变圆、皱缩的细胞明显减少，但不及正常组和银杏叶提取物组。银杏叶提取物组呈剂量依赖性的增加细胞的活力，其中高剂量组的细胞生长同正常组相似（见图2）。

图2 正常组、IL-1β组、地塞米松组（10-6mmol/L）、银杏叶提取物高剂量组（160 mg/L）软骨细胞形态（×400）

2.2 银杏叶提取物对IL-1β损伤关节软骨细胞MMP-3、TIMP-1的影响 IL-1β作用软骨细胞后MMP-3分泌显著增多，TIMP-1分泌显著减少（P＜0.01）；EGb能对抗IL-1β的这种效应，并呈剂量依赖性；地塞米松也有同样的效应（P＜0.05）（见表1）。

表1 EGb对IL-1β损伤关节软骨细胞MMP-3和TIMP-1分泌的影响（±s，n=6）

表1 EGb对IL-1β损伤关节软骨细胞MMP-3和TIMP-1分泌的影响（±s，n=6）

注：与正常组比较，﹡P＜0.01；与IL-1β组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与银杏叶提取物80 mg/L组比较，☆P＜0.01

正常组IL-1β组地塞米松10-6mmol/L银杏叶提取物40 mg/L银杏叶提取物80 mg/L银杏叶提取物160 mg/L MMP-3（ ng/mL）30.240 2±2.31 52.632 8±3.71﹡41.260 8±3.45△44.531 8±4.34△36.578 1±3.07△△30.501 8±3.09△△☆TIMP-1（ ng/mL）23.23±3.94 10.497±1.07﹡15.492 8±1.98△14.935±1.19△17.654 8±2.05△△19.659 1±2.04△△☆

3 讨论

骨关节炎的研究越来越多地证明，细胞因子在OA的发生、发展、恶化中起着重要的调节作用。同OA发病最密切相关的就是IL-1[1]。实验表明，经IL-1β处理后的软骨细胞，在倒置显微镜下细胞活力降低、部分细胞变圆、皱缩。本实验采用IL-1β作用于兔膝关节软骨细胞，发现IL-1β作用软骨细胞后MMP-3分泌显著增多，TIMP-1分泌显著减少，证实IL-1β的膝关节损害作用。

MMPs是降解骨有机质(主要是胶原蛋白)的非常重要的酶之一。MMPs的活性可被特异性TIMPs所抑制。在关节软骨的破坏中，MMP-3和TIMP-1尤为重要，这是因为MMP-3除了可降解Ⅳ型胶原，可能与OA早期胶原网络水肿有关外，还可激活MMP-1，加速胶原的病理性降解，使与透明质酸相连的可聚蛋白多糖由于网络的松解而丢失；而TIMP-1则可抑制关节软骨胶原纤维的释放[2]。目前，临床上将MMP-3和TIMP-1作为OA患者关节炎症的血清标记物进行测定，并探讨了OA患者MMP-3和TIMP-1的血清水平与疾病的活动相关性。

银杏叶甘、苦、涩、平，入肺、脾、胃经，具活血止痛、敛肺平喘、涩肠止泻、止带浊功效，是近年来应用比较广泛的药物。由于银杏叶提取物具有的清除氧自由基、改善细胞的代谢活动等多方面的作用，银杏叶提取物目前广泛用于抗衰老和心脑血管疾病的治疗和保健用药[3]。在临床应用中发现可改善部分老年OA患者的症状，本实验研究结果显示银杏叶提取物对经IL-1β损伤的软骨细胞可以有效的减少MMP-3的生成，并增加TIMP-1的生成。进一步证实银杏叶提取物对受损伤关节软骨细胞具有保护作用。

[1]陈启明，梁国德，秦岭，等主译.骨科基础科学－骨关节肌肉系统生物学和生物力学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2001：412.

[2]王毅，邢国胜，于顺禄，等.IL-1β诱导软骨细胞培养金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制剂水平及药物对其影响[J].中华风湿病学杂志，2003，(12)：718.

[3]Dubey AK，Shankar PR，Upadhyaya D，et al.Ginkgo biloba-an ap⁃praisal〔J〕.Kathmandu Univ Med J(KUMJ)，2004，2(3)：225.

Effect of Ginkgo Biloba Extract(EGb761)on MMP-3 and TIMP-1 and Damaged Chondrocytes of Knee-joint Injured by IL-1β in Rabbits

Zhao Dongjie,Wang Jun,He Bingrong.Zhejiang Provincial Hospi⁃tal of Traditional Chinese and Western Medicine（310003）,China

ObjectiveTo observe the protective effects of Ginkgo Biloba Extract(EGb761)on damaged chondrocytes of knee-joint injured by rratIL-1β in rabbits and to explore the protective mechanism of EGb761 through MMP-3 and TIMP-1.MethodsCartilaginous layers of knee were separated from three-month old Newzealand rabbit under semi-asepsis environment and then digested under sterile environment to get cartilagi⁃nous cells.The experimental cells were the second generation cartilaginous cells,identified with extracellular ma⁃trix in culture.These cells were observed by inverted microscopy and then were taken photos.Chondrocytes were divided randomly into six groups cultured with different cultures：rratIL-1β(5 μg/L)group,rratIL-1β(5 μg/L)with dexamethasone(10-6mmol/L)group,rratIL-1β(5 μg/L)with EGb761(40 mg,80 mg,160 mg/L)group and control group.After 24 hours,rabbit matrix MMP-13 and TIMP-1 content were detected by ELISA assay.ResultsThe production of MMP-13 was increased and TIMP-1 was decreased,Dexamethasone and EGb761 could rival the effect and EGb761 with dose-dependent response.ConclusionRGb761 could protect the damaged chondrocyte of articular genu injured by rratIL-1β in rabbit.The protective mechanism of EGb761 was to decrease production of MMP-13 and increase production of TIMP-1.EGb761 may be a new medicine to pre⁃vent osteoarthritis.

ginkgo biloba extract,osteoarthritis,matrix metalloproteinase,tissue type inhibitor of metallopro⁃teinases

R684.3；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0072-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.026

浙江省中西医结合医院老年病科（杭州 310003）

赵东杰，Tel：0571-56109712,E-mail：zhaodongjie12 34@sina.com.cn

（收稿：2010-05-06 修回：2010-10-12）

（责任编辑 刘洪斌 田在善）