复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的动态影响

王振宜，肖秀丽，唐汉钧

复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的动态影响

王振宜1，肖秀丽2，唐汉钧3

目的：动态观察复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面新生肉芽组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的动态影响。方法：36只雄性Wistar大鼠随机分为创面对照组、模型组、复黄膏组。采用荧光定量PCR技术，观察不同时段创面新生肉芽组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的变化。结果：创面修复第11 d，Ⅰ型胶原mRNA表达复黄膏组明显低于创面对照组(P<0.05)，但和模型组比较无统计学差异；Ⅲ型胶原mRNA表达复黄膏组明显高于模型组(P<0.05)，和创面对照组比较差异无统计学意义。结论：复黄生肌愈创油膏通过促进难愈性创面Ⅰ、Ⅲ型胶原增殖和平衡，从而起到促进创面愈合的作用。

复黄生肌愈创油膏；创面愈合；大鼠；糖尿病

创面愈合是外科领域中一个重要问题，糖尿病、 截瘫、局部射线照射等所致的创面愈合困难。探究创面修复与再生的机理,寻找有效地促进创面愈合的治疗方法,有着十分重要的意义。复黄生肌愈创油膏是唐汉钧教授根据长期治疗皮肤创面的经验所制,在临床上取得了较好的临床疗效。为进一步探讨复黄生肌愈创油膏（简称复黄膏）促进创面愈合的机制,我们通过大鼠糖尿病创面模型外用复黄生肌愈创油膏后创面Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的动态研究,探讨其部分作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级Wistar大鼠，雄性，(220±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（批号医动字第scxk（沪）2003－0003号）。用随机数字表法将大鼠随机分为创面造模后换药3 d和11 d二个观测时段。每个时段又分为创面对照组、模型组和复黄膏组，每组各6只。

1.2 药物组成及制备 复黄生肌愈创油膏（复黄膏）由紫草、血竭、大黄、龙骨、鸡蛋黄，珍珠层粉、猪皮，麻油组成。由上海中医药大学龙华医院制剂室制备成油膏（药剂批号为040720）。正常对照组和糖尿病对照组用生理盐水。

1.3 试剂和仪器 四氧嘧啶（Alloxan），试剂编号：2244-11-3，瑞士FULKA公司产品（由上海中医药大学药理毒性实验室提供）。罗氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖仪和血糖测试试纸，编号：2005-10,22896931,瑞士Roche公司产品。0.1%盐酸氯胺酮，试剂编号：KD061201，江苏恒瑞医药股份有限公司产品。RT试剂盒DR019A，广州中山大学达安基因股份有限公司产品。MARK D501A，上海宝生物工程技术公司产品。RNA反转录试剂盒，TAKARA公司产品。实时荧光定量PCR试剂盒，美国ABI公司产品。全自动实时荧光定量PCR仪（ABI 7300），国ABI公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 动物创面造模 糖尿病大鼠模型制造参照付小兵等[1]方法改进，随机分为创面对照组、模型组和复黄膏组。禁食24 h（饮水不限），在乙醚麻醉下尾静脉1次注射1.5%四氧嘧啶（50 mg/kg，实验组）及等体积生理盐水（对照组），造模后4 h后给予5%葡萄糖水溶液饮用。次日经尾部取血测血糖，血糖值大于10 mmol/L以上，则表明造模成功。模型制成后，每3 d测血糖1次，直到动物处死。创面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后3 d，参照付小兵等[2]方法改进，Wistar大鼠用1%盐酸氯胺酮（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。局部备皮，常规消毒，于Wistar大鼠背部取直径为3 cm左右圆形切口，剪开皮肤全层，至皮下筋膜，无菌敷料加盖，每日换药1次。创面对照组造模方法同上。

1.4.2 用药 3组大鼠于造模当日开始换药，换药前用1：5 000呋喃西林清洁创面。创面对照组和模型组外敷单层生理盐水纱布，复黄膏组外敷单层复黄膏纱布。3组大鼠伤口均外用两层消毒干纱布覆盖固定，每日换药1次。

1.4.3 动物创面面积测量及标本采集 用药后第3 d和第11 d，分别将动物麻醉处死。测量创伤面积，并计算创面闭合指数。计算公式：创面闭合指数＝（1－治疗后创面面积/原始创面面积）×100%[3]。用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，并成块取下，为所需实验样品。

1.4.4 Real-time RT-PCR实验步骤

1.4.4.1 引物、探针的设计与合成 根据GenBank提供的CRD-BP mRNA序列（LOCUS ID：AF198254），利用Primer Premier 5.0设计内、外引物及探针，引物均跨内含子序列，保证扩增的特异性（引物、探针由中山大学达安基因诊断中心合成）。见表1。

表1 引物和探针序列

1.4.4.2 RT-PCR 组织RNA提取、RNA浓度测定、RNA变性凝胶电泳反应体系为：5×逆转录buffer 4 μL、上游引物F 0.4 μL、下游引物R 0.4 μL、dNTPs 0.2 μL、逆转录酶MMLV 1 μL、DEPC处理水10 μL、RNA模板4 μL，总体积20 μL。依次插入预先设置（37℃ 1 h、95℃ 5 min）加热模块。逆转录cDNA完成，放入－80℃冰箱备用。

1.4.4.3 FQ-PCR检测 96孔联体反应板，分别加入cDNA模板。依次加入Taq酶1 μL、dNTPs 0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、荧光标记探针0.5 μL、5×buffer 10 μL、ddH2O 32 μL、cDNA 5 μL，总体积50 μL。放入全自动实时荧光定量PCR仪（美国ABI 7300）板槽中。扩增条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40个循环，反应完数据保存。计算公式：mRNA相对表达量=2-△△Ct×100%，ΔCt=目标基因CT值-内参（GAPDH）CT值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件包对相关数据进行统计分析。在统计过程中进行了正态分布检验和方差齐性检验，数据满足方差分析条件，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 创面闭合指数的影响 在用药第3 d和第11 d，模型组的创面闭合指数均明显低于创面对照组（P<0.05）；复黄膏组的创面闭合指数则明显高于模型组（P＜0.05），与创面对照组相当（P>0.05）。见表2。

表2 复黄膏用药第3 d和第11 d对大鼠糖尿病创面闭合指数的影响(±s，%)

表2 复黄膏用药第3 d和第11 d对大鼠糖尿病创面闭合指数的影响(±s，%)

注：与创面对照组相比，*P<0.05,与模型组相比，▲P<0.05

组别创面对照组模型组复黄膏组n 创面闭合指数第3 d 第11 d 6 6 6 3.10±1.53 0.78±0.57*2.36±1.30▲77.55±10.00 42.39±9.78*78.01±8.85▲

2.2 对创面中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

修复第3 d，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达3组间比较无统计学差异，见表3。创面修复的第11 d，Ⅰ型胶原mRNA表达复黄膏组明显低于创面对照组(P<0.05)，但和模型组比较无统计学差异；Ⅲ型胶原mRNA表达复黄膏组明显高于模型组(P<0.05)，和创面对照组比较差异无统计学意义，见表4。

表3 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面3 dⅠ型和Ⅲ型胶原mRNA水平影响(%,±s)

表3 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面3 dⅠ型和Ⅲ型胶原mRNA水平影响(%,±s)

注：与创面对照组相比，*P<0.05,与模型组相比，▲P<0.05

组别创面对照组模型组复黄膏组n6 6 6Ⅰ型胶原2.37±2.85 1.98±1.14 1.49±1.32Ⅲ型胶原2.80±3.55 0.69±0.62 2.49±3.26

3 讨论

复黄生肌愈创油膏是根据糖尿病溃疡“虚甚瘀重，瘀甚虚重”的病机立法，以祛瘀扶正,方以大黄、蛋黄油为主药，一以活血祛瘀，一以扶正生肌；以紫草、血竭助大黄祛瘀止痛，珍珠粉等助蛋黄油生肌收口，佐以龙骨收疮敛口，麻油生肌润肤。全方合用，有活血祛瘀、生肌收口之功效，在临床促进难愈性创面愈合治疗上取得了一定的疗效[4]。本实验的动物模型创面闭合指数结果显示，糖尿病实验组结果接近正常对照组的愈合指数，而明显优于糖尿病对照组，同临床治疗结果相一致。

表4 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面11 dⅠ型和Ⅲ型胶原mRNA水平影响(%，±s)

表4 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面11 dⅠ型和Ⅲ型胶原mRNA水平影响(%，±s)

注：与创面对照组相比，*P<0.05，与模型组相比，▲P<0.05

组别创面对照组模型组复黄膏组n 6 6 6Ⅰ型胶原7.16±5.93 0.87±0.62*1.77±0.99*Ⅲ型胶原2.33±1.98 0.45±0.24 3.56±2.31▲

胶原在创伤修复中是构成修复组织的主要细胞外基质成分，对于修复过程的完成有着极其重要的作用。愈合初期成纤维细胞被激活，合成和分泌胶原，胶原的产生既是创面修复的重要过程，也是瘢痕形成过程的决定性因素，故调控胶原的合成对于促进创面愈合，减少瘢痕形成有着重要的意义。而胶原的类型很多，其中含量最丰富的是I型和Ⅲ型胶原，在创面愈合过程中，I、Ⅲ型胶原起着重要作用。胶原在创面修复过程中，作为修复质量的终结指标，决定着创面是否能顺利修复，以及修复质量高低[5]。

我们在实验中发现：在创面修复的第3 d，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达3组间比较无统计学差异；但复黄膏组Ⅲ型胶原mRNA表达明显高于模型组，和创面对照组相当。愈合的伤口中Ⅲ型胶原出现得比I型胶原早，含量增加[6]。本结果提示，在组织动态修复过程中Ⅰ、Ⅲ型胶原在创面初期相互平行，应用复黄油中药后Ⅲ型胶原在糖尿病创面修复起始阶段就呈现上升趋势。在创面修复的第11 d，Ⅰ型胶原mRNA表达复黄膏组明显低于创面对照组(P<0.05)，但和模型组比较无统计学差异；Ⅲ型胶原mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)，但和创面对照组比较无统计学差异。提示应用复黄生肌愈创油膏具有促进Ⅰ型、Ⅲ型胶原增生作用。I型胶原纤维直径为100～500 nm，Ⅲ型胶原直径为40～60 nm，Ⅲ型胶原含量越高，胶原纤维越细，弹性越好，说明瘢痕的纤维化程度越低，胶原纤维就越细，形成的瘢痕就越轻，故提高Ⅲ型胶原比例是减少瘢痕的重要手段[7]。我们实验结果提示，在创面修复后期，复黄膏可促进Ⅲ型胶原分泌，提高Ⅲ型胶原含量，这可能是复黄生肌愈创油膏促进创面愈合减少瘢痕形成的机理之一。

复黄生肌愈创油膏通过促进糖尿病溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原增殖和调节其平衡，从而起到促进创面愈合的作用。

[1]付小兵，王亚平，孙同柱,等.糖尿病慢性难愈合创面大鼠模型的制备[J].上海实验动物科学杂志,1997，17（4）：217.

[2]付小兵.几种用于创伤修复研究的动物模型[J].中华实验外科杂志,1999，16（5）：479.

[3]冯江，杜文华，王劲,等.中国修复重建外科杂志[J].1999,13(5)：273.

[4]王林扬，唐汉钧.复黄生肌愈创油膏对皮肤溃疡修复作用的实验研究[J].中医外治杂志，1999,8(4)：8.

[5]付小兵，王正国．现代高新技术与创面修复[M]．北京：人民军医出版社，2002：239.

[6]Gallant CL,Olson ME,Hart DA.Molecular,histologic,and gross phenotype of skin wound healing in red Duroc pigs reveals an abnormal healing phenotype of hypercont racted,hyperpigment⁃ed scarring[J].Wound Repair Regen,2004,12(3)：305.

[7]张剑,向军,王志勇,等.真皮“生物模板”对创面愈合中胶原影响的研究[J].上海第二医科大学学报,2003,23(5)：393.

Effects of Fuhuang Shengji Yuchuang(复黄生肌愈创)Ointment on Expressions of Type I and III Colla⁃gens mRNA in Granulation Wound Tissue in Rats with Diabetes

Wang Zhenyi,Xiao Xiuli,Tang Hangjun.Department of Anorectal Surgery,Yueyang Hospital of ITCWM Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai（200437）,China

ObjectiveTo observe the effects of Fuhuang Shengji Yuchuang(FHSJYC)(复黄生肌愈创)oint⁃ment,a compound traditional Chinese herbal medicine,on the expressions of type I and III collagens mRNA in wound granulation tissue in rats with diabetes.MethodsWistar rats were randomly divided into three groups：wound control group,normal saline(NS)group and FHSJYC group.Diabetes was induced by injection of 1.5%alloxan and oral gavage of 5%glucose,and skin wound was made in rats of the NS group and FHSJYC group.Skin wounds of the rats in the FHSJYC group were treated with FHSJYC ointment gauze dressing,while those in the NS group were treated with NS gauze dressing once daily.The rats were executed in turn on the third day and the eleventh day of the treatment,and the changes of type I and III collagen mRNA in the wound granula⁃tion tissue were observed by fluorescent real time quantitative polymerase chain reaction.ResultsCompared with the NS group,the wound closure index in the FHSJYC group was increased(P<0.05)After 3-day treat⁃ment,the expression of type I and III collagens mRNA showed no significant differences among the three groups.After 11-day treatment,the expression of type I collagen mRNAs in the FHSJYC group was lower than that in the wound control group(P<0.05),similar with those in the NS group.The expression of type III colla⁃gen mRNA in the FHSJYC group was higher than that in the NS group(P<0.05),similar with that in the wound control group.ConclusionFHSJYC ointment can affect the process of wound healing by promoting and regu⁃lating the expressions of type I and III collagens mRNA.TheseConclusionshow effects in accelerating wound heal⁃ing and minimizing scar proliferation in uncurable wound.

Fuhuang ShengJi Yuechuang ointment,wound healing,rats,diabetes

R587.1；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0063-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.023

高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20050268012）

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肛肠科(上海 200437）

2.上海中医药大学附属曙光医院宝山分院中医外科(上海 201900）

3.上海中医药大学附属龙华医院中医外科(上海 200032）

（收稿：2010-05-26 修回：2010-08-22）

（责任编辑 刘洪斌 田在善）