VEGF-C和FLT-4在结直肠腺癌中的表达

关 蕾，孙地武，刘长宝

VEGF-C和FLT-4在结直肠腺癌中的表达

关 蕾1，孙地武2，刘长宝1

目的：研究VEGF-C和FLT-4在结直肠腺癌、癌旁组织以及正常肠组织的表达，探讨其在结直肠腺癌淋巴转移中的关系。方法：收集结直肠腺癌癌灶、癌旁组织和正常肠组织标本，分别采用免疫组化、HE染色检测癌灶组和癌旁组、正常组的VEGF-C表达水平，癌旁组与正常组的淋巴管数，并分析二者与结直肠腺癌淋巴转移和临床病理特征之间的关系。结果：癌灶组和癌旁组、正常组的VEGF-C表达水平有显著性差异，癌旁组与正常组的FLT-4(阳性淋巴管数)表达水平具有显著性差异，其中VEGF-C免疫组化染色的阳性率与FLT-4阳性染色脉管数在TNM分期中的0～II期和III～IV期间有显著性差异。结论：联合检测VEGF-C和FLT-4在结直肠腺癌灶及癌旁组织中的表达，对结直肠腺癌淋巴转移有一定的预测价值，可以作为人结直肠腺癌淋巴转移的预测指标。

结直肠腺癌；VEGF-C；FLT-4；淋巴管生成；转移

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)近年来在我国发病率及死亡率呈明显上升趋势。据报道,60%以上的患者于初次诊断时已发现有转移,尽管采取了手术、放化疗、免疫等综合性治疗措施,但其预后仍不容乐观,术后5年生存率仅为40%～60%[1],约有80%～90%死于肿瘤转移。结直肠癌淋巴结转移率约为30%～50%，其中早期癌的转移率约为10%[2-4]，淋巴转移[5]严重影响结直肠癌患者的预后。我们于2009年4月—2010年6月，通过检测淋巴管内皮生长因子VEGF-C、血管内皮生长因子受体家族成员FLT-4在结直肠腺癌中的表达情况，分析其在临床运用的可行性，为临床上结直肠肿瘤的诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全组共47例，结直肠癌组将标本按取材部位分为原发灶癌组织、癌旁组织、远端肠管。其中，癌旁组织、远端肠管分别选取距离癌灶2 cm、10 cm处肠管。正常组织选取31例PPH术切除正常直肠组织标本作为对照。结直肠癌组47例，年龄34～82岁，平均62.3岁。男34例，女13例。肿瘤最大直径小于5 cm者20例，大于5 cm者37例。溃疡型30例，非溃疡型17例。管状腺癌及乳头状腺癌45例，黏液腺癌2例。未达浅肌层8例，达深肌层14例，达浆膜层22例和浆膜外3例。高分化组12例，中分化组29例，低分化组6例。按TAM分期标准0期4例，I期5例，II期15例，III期14例，IV期9例。结肠组16例和直肠组31例。有淋巴结转移17例，无淋巴结转移30例。PPH组31例，年龄16～80岁，平均47.23岁。男19例，女13例。痔病23例（包括内痔、外痔、混合痔），非痔病8例（包括直肠黏膜脱垂）。

1.2 组织标本处理 遵照《病理学基础与实验技术》[6]，标本经10%福尔马林固定24 h，分别取癌灶、癌旁（距离癌灶2 cm）、正常肠组织，裁成大小1 cm×1 cm×0.5 cm。常规脱水，透明、浸蜡、包埋，连续切片（4 μm/片），摊片、裱片、烤片。

1.3 HE染色 ⑴切片常规脱蜡。⑵苏木素染色3 min。⑶1%盐酸酒精中分化。⑷1%的氨水返蓝10 s，自来水冲洗5 min。⑸伊红染色1 min。⑹梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 免疫组织化学染色 每例石蜡组织均取切片5张，3张分别做VEGF-C和FLT-4蛋白免疫组化染色，1张进行HE染色，1张作为阴性对照。切片常规脱蜡至水化,置2 000 mL枸橼酸酸盐缓冲液(pH 6.0)中,高压加热(95℃,7.5 min)修复抗原，3%H2O2室温孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶。一抗为兔抗人VEGF-C、FLT-4多克隆抗体（均购自北京中杉金桥生物技术开发公司）。具体实验步骤按照PV9000二步法免疫组化检测试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术开发公司)说明书进行。

1.5 检测判断 ⑴VEGF-C的计数方法和标准：在组织切片中VEGF-C显示胞浆或胞膜染为淡黄色至棕褐色为阳性细胞标志。在×40倍镜下随机选取5个具有代表性的VEGF-C阳性染色癌细胞最密集区，然后在×400倍视野下记数5个视野中的500个癌细胞(100个细胞/视野)，以阳性细胞占肿瘤细胞的百分率来表示(%)。⑵FLT-4阳性脉管判断标准及记数方法：随机选取切片，首先在×40倍镜下寻找FLT-4阳性脉管密集区，确定每张切片5个淋巴管最多区域，再在×200视野下计数每个区域的淋巴管数，取平均值。凡不成腔、或有红细胞、或伴有肌层的脉管均不予计数。

1.6 统计学方法 符合正态性分布的计量资料以均值±标准差(±s)表示，两组间比较采用两样本间t检验，计数资料组间采用χ2检验，两个变量相关性采用Spearman相关分析。所有数据处理均用SPSS 17.0统计软件进行运算。取显著性检验水准P<0.05。

2 结果

2.1 HE结果 经HE染色，显示癌灶组均为腺癌，癌旁组均无未见癌细胞侵犯，正常组均为未见细胞异常，除有炎性表现外，基本为正常黏膜。见图1～图6。2.2 VEGF-C、FLT-4在结直肠癌、癌旁组织和正常

图1 高分化腺癌×200（降结肠，女，53岁）

图2 正常肠组织×400（直肠，男，35岁）

图3 中分化腺癌×200（乙状结肠，男，74岁）

图4 癌旁组织×400（直肠，男，65岁）

图5 低分化腺癌×200（直肠，男，65岁）

图6 癌旁脉管组织×200（直肠，男，65岁）组织的免疫组化表达 癌旁组VEGF-C染色阳性率与癌灶组、正常组和癌旁组比较有显著差异。癌旁组石蜡切片中FLT-4阳性染色脉管数与正常直肠组织中FLT-4阳性染色脉管数比较有显著性差异。两组免疫组化染色后计数结果见表1。

表1 结直肠癌、癌旁组织和正常组织中VEGF-C、FLT-4的表达(±s)

表1 结直肠癌、癌旁组织和正常组织中VEGF-C、FLT-4的表达(±s)

注：与癌灶组比较，*P<0.05,与正常组比较,△P<0.05

n FLT-4表达阳性淋巴染色脉管数组别癌灶组正常组癌旁组47 31 47 VEGF-C表达阳性率（n，%）45(95.7)16(51.6)*39(83.0)△4.30±1.49 9.06±3.1△

2.3 VEGF-C、FLT-4在不同临床病理特点结直肠癌组中的表达 ⑴按淋巴结是否有转移将癌灶组分为两个级别。⑵按照肿瘤最大直径将癌灶组分为两个级别，即直径≤5 cm和＞5 cm。⑶按TNM分期将癌灶组分为0～IV期分级。

癌灶组淋巴结转移病人中VEGF-C阳性表达率与无淋巴结转移组VEGF-C阳性表达率比较，差异无统计学意义。癌灶组的VEGF-C免疫组化染色的阳性率在按肿瘤大小分级的两个级别间差异无显著性。结直肠腺癌VEGF-C免疫组化染色的阳性率在0～IV期间有显著性差异，表明VEGF-C的表达与肿瘤转移有关。癌旁组淋巴结转移病人FLT-4阳性染色脉管数与无淋巴结转移病人FLT-4阳性染色脉管数比较，差异有统计学意义。癌旁组FLT-4阳性染色脉管数在按肿瘤大小分级的两个级别间差异无显著性，表明其与肿瘤大小无关。癌旁组FLT-4阳性染色脉管数在按肿瘤病理TNM分期的0～II期和III～IV期间有显著性差异，表明其与肿瘤淋巴转移有关，见表2。

表2 癌灶组VEGF-C蛋白表达及FLT-4阳性染色脉管数与CRC临床病理因素的关系(±s)

表2 癌灶组VEGF-C蛋白表达及FLT-4阳性染色脉管数与CRC临床病理因素的关系(±s)

注：两组间比较，*P<0.05

淋巴结转移有无VEGF-C阳性VEGF-C阴性阳性率（%）脉管数17 0 100 10.5±3.18 28 2 93.30 8.24±3.18*肿瘤最大直径≤5 cm ＞5 cm 27 0 100 9.74±2.69 18 2 90 8.15±3.26 TNM分期0～II III～IV 22 2 91.70 7.29±2.56 23 0 100*11.08±2.17*

3 讨论

随着我国疾病谱和饮食结构的变化,结直肠癌的发病率呈上升趋势,特别是在城市上升更为明显[7]。多年来，CRC的5年生存率始终徘徊在50%左右,原因主要在于结直肠癌的转移，其中淋巴转移是常见的转移途径之一，也是影响预后最主要的因素。转移是肿瘤的重要生物学特性，而淋巴转移更是直接影响结直肠癌患者的预后[8]。因此，很多国内外学者都致力于CRC淋巴转移规律和机制方面的研究。随着淋巴管标志物的发现，对肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的研究成为的研究热点领域[9]。

本研究中癌旁组淋巴结转移病人为17例，FLT-4阳性染色脉管数为（10.5±3.18）。无淋巴结转移病人为30例，FLT-4阳性染色脉管数为（8.24±3.18）。两组比较差异有统计学意义，表明癌旁组织的淋巴管增生，促进了肿瘤的淋巴结转移。

Saaristo A等[10]研究发现，VEGF-C诱导淋巴管生成，参与细胞水液代谢和免疫调节功能、炎症增生、肿瘤转移等过程。联系Tammela等研究结果[11]，结合本实验，可以认为VEGF-C是肿瘤细胞分泌的，并可能通过旁分泌与淋巴管内皮细胞上的FLT-4结合，激活后者来调控淋巴管的功能变化，促进腺癌的发生发展、播散转移。VEGF-C和FLT-4的增加导致转移增高的原因可能是VEGF-C与淋巴管内皮细胞上的FLT-4结合并激活后者，调节淋巴管的生长能力和通透性，诱导癌周的淋巴管增生和扩张，促进肿瘤细胞对淋巴管的侵袭，增加肿瘤细胞转移的机会。

目前，临床上判断结直肠癌是早期还是中晚期，主要依靠术前CT[12]或腹部B超检查是否有淋巴转移，低位直肠癌可行直肠内B超检测浸润范围[13]，术中术者在术野下可判断有否是淋巴转移。但是，对于离肿瘤较远的淋巴结或仅有微小转移的淋巴结，其诊断准确率明显降低。若术前或术中未发现淋巴转移，手术未行淋巴结清扫，或清扫不彻底，而仅依靠术后病理判断患者结直肠癌分期，则会影响患者预后，乃至生存率。所以，亟待一种术前的检测作为参考指标，判断手术方案。本实验研究发现，癌旁组FLT-4阳性染色脉管数在按肿瘤病理TNM分期的0～II期和III～IV期间有显著性差异，表明其与肿瘤转移有关。同时，结直肠腺癌原发灶VEGF-C的阳性率在0～IV期间也有显著性差异，表明VEGF-C的表达也与肿瘤转移有关。笔者认为，临床医生可根据术前血清中的FLT-4及VEGF-C水平，预测肿瘤患者是否有淋巴结和远隔器官转移，判断是否有微小转移灶的存在，为手术方案、术后是否行化疗以及化疗方案提供了依据。

在临床应用中,我们认为VEGF-C和FLT-4可以作为检测指标联合应用，有利于结直肠肿瘤转移的综合判断，改善疾病的预后。尤其是在对DukesB期病人治疗上，对其手术中是否进行淋巴结清扫，及术后是否进行化疗，有重要参考价值。

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Expression of VEGF-C and FLT-4 in Colorectal Carcinoma and Correlation with Tumor Metastasis

Guan LeiSun Diwu Liu Changbao.The SecondAffiliatedHospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang Province(325027)，China

ObjectiveTo investigate the expression in colorectal adenocarcinoma of the relationship be⁃tween the lymph node metastases，and to provide support for whether lymphatic cleaning and to postoperative chemotherapy should be done to patients.MethodsThe colorectal adenocarcinoma foci adjacent tissues and normal colorectal mucosa specimens were Collected and detected them respectively with PV9000 2-step immuno⁃histochemical staining and HE staining：VEGF-C expression levels：the expression of VEGF-C in the primary fo⁃ci of colorectal carcinoma,adjacent tissues and the normal group;the numbers of lymphatic in paraneoplastic group and normal group;and the relation between these two things and the lymphatic metastasis of colorectal ad⁃enocarcinoma and clinical pathological features was analyzed.ResultsThe expressions of VEGF-C in colorec⁃tal adenocarcinoma foci,paraneoplastic group and the normal group are significantly different.The expressions of FLT-4 in paraneoplastic group and normal groups are strikingly different.The positive rate of the VEGF-C immunohistochemistry pigmentation and the number of FLT-4 masculine pigmentated vessels are quite different in the 0-II and III-IV periods in the TNM division.ConclusionTo jointly detect the expression of VEGF-C and FLT-4 in the colorectal adenocarcino⁃ma foci and paraneoplastic group of colorectal adeno⁃carcinoma is quite valuable in the prediction of the lymphatic metastasis in human being’s colorectal adenocarci⁃noma.The joint detection can be used as prediction index to the lymphatic metastasis in human being’s colorec⁃tal adenocarcinoma and it is with great reference value especially to the treatment of the patients in clinical Dukes B period.

Colorectal Neoplasms,Vascular Endothelial Growth Factor C，VEGF Receptor-3,Lymphatic Metastasis(metastasis)

R735.3+5

A

1007-6948(2011)01-0056-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.021

温州市科技局项目（Y20090436）

1.温州医学院附属第二医院肛肠科(温州 325027)

2.成都军区空军机关医院外科

刘长宝,Tel：0577-88086251，E-mail：lcb@wzhealth.com

（收稿：2010-08-20 修回：2010-11-22）

（责任编辑 孔 棣）