RP-HPLC法检测大鼠血浆大黄酸含量的经时变化

薛小平，鹿燕敏，李东华，刘洪斌

RP-HPLC法检测大鼠血浆大黄酸含量的经时变化

薛小平，鹿燕敏，李东华，刘洪斌

目的：观察大鼠口服清热解毒方后，其有效成分大黄酸在大鼠血浆中的经时变化规律。方法：采用RP-HPLC法，色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸（85∶15）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温35℃。结果：大鼠口服清热解毒方后，血浆中大黄酸1 h达峰值，之后缓慢下降，于12 h内基本代谢完全。结论：采用反相高效液相色谱法检测大鼠体内药物含量简便、快捷，适合于研究中药类成分的代谢特征。

大黄酸；反向高效液相色谱法；清热解毒方

清热解毒方主要由大黄、黄芩、白头翁、败酱草等组成，以东汉张仲景《金匮要略》泻心汤方：“大黄二两，黄连、黄芩各一两”为基础加减化裁而来。该方具有通里攻下、清热泻火、凉血解毒之功效。长期临床观察显示，其对化脓性阑尾炎、阑尾脓肿及其他多种原因引起的腹腔感染等具有良好疗效[1]。大黄酸是方中君药大黄的主要成分之一，具有广泛的药理学活性[2]。本实验采用反向高效液相色谱法，对口服清热解毒方后不同时间点的大鼠血浆中的大黄酸的含量进行测定，探讨清热解毒方在大鼠体内的代谢特征。

1 材料与方法

1.1 材料 Aglient1100高效液相色谱仪，安捷伦公司；电子天平（SARTORINS,德国）；高速低温离心机（Laboratory Centrifuges 3K-30，美国Sigma）；KQ3200型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

大黄酸对照品购自中国药品生物制品检定所（批号0757-9804）；甲醇（天津市康科德科技有限公司）为色谱纯，磷酸（天津市化学试剂三厂）、乙醚（天津市赢达稀贵化学试剂厂）均为分析纯；硫酸为优级纯；水为自制重蒸水。清热解毒方实验用药由华西药学院提供，制成生药量1 g/mL的浓缩煎剂（批号20081212）。

实验动物：健康Wistar大鼠36只，体质量(200±10)g，雌雄各半，由军事医学科学院四所动物室提供（合格证号：DD20013）。

1.2 方法[3-4]

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸（85：15）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。

1.2.2 大黄酸对照品储备液的制备 精密称取大黄酸0.74 mg，加甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，置4℃冰箱保存。

1.2.3 给药方法及血浆药物提取 Wistar大鼠36只，随机分为6组，每组6只，给药前禁食12 h，自由饮水，按24 g生药/kg体质量灌胃给予泻心汤中药，分别于给药后0.5、1、2、4、8、12 h各6只自腹主动脉取血，血样经肝素钠抗凝后分取血浆4℃保存。

微量取样器精密吸取大鼠血浆500 μL，置离心管中，加15%H2SO4250 μL，漩涡混合30 s，70℃水浴水解30 min，冷却，加入乙醚4.0 mL，漩涡混合提取5 min，3 000 r/min离心5 min，吸取乙醚层，通入压缩氮气挥干。临用前用甲醇溶解进样。

1.2.4 定性定量方法 采用色谱峰保留时间进行定性分析，采用外标标准曲线法进行定量分析。

2 结果

2.1 系统适用性实验 在本实验条件下，大黄酸的峰形良好，与血浆中内源性物质分离良好，保留时间在6.23 min左右，见图1～3。目标峰无杂峰干扰，本实验具有较好的专属性。

图1 大鼠空白血浆中加入大黄酸对照品色谱图(A为大黄酸)

图2 大鼠口服清热解毒方后血浆样品中大黄酸的色谱图(A为大黄酸)

图3 大鼠空白血浆色谱图

2.2 线性范围及检测限 精密吸取大黄酸对照品适量，加至6份正常大鼠血浆中，分别制成含大黄酸浓度为 0.37、0.74、1.48、2.22、2.96、3.7 μg/mL 的溶液，按1.2.3项下处理测定。以对照品质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程：Y=35.516X－0.112 3，r2=0.999 1，n=6，大黄酸在0.37～3.7 μg/mL范围内线性关系良好，最低检测浓度为0.04 μg/mL。

2.3 回收率及精密度实验 对照品挥干残渣与空白血浆混合，配成分别含有大黄酸0.08、0.40、1.60 μg/mL的溶液，按1.2.3方法处理，每个浓度3份，分别取10 μL进样，记录峰面积A0。同时取大黄酸对照品用甲醇分别配制成相应浓度的溶液，每个浓度3份，取10 μL进样，记录峰面积A1，按萃取回收率（%）=A0/A1×100%计算（结果见表1）。上述浓度的含药血浆在同一天重复测定5次，在1周内不同日期重复测定5次，分别计算日内和日间的相对标准偏差，日内RSD分别为2.38%、2.25%、2.85%；日间RSD分别为3.05%、3.58%、3.73%。

表1 回收率实验(±s，n=9)

表1 回收率实验(±s，n=9)

编号1 2 3 4 5 6 7 8 9标准品浓度(μg/mL)0.08 0.08 0.08 0.40 0.40 0.40 1.60 1.60 1.60测得量(μg/mL)0.0572 0.0581 0.0575 0.289 0.292 0.291 1.189 1.125 1.157回收率(%)71.5 72.6 71.9 72.3 73.1 72.8 74.3 70.3 72.3加样回收率(%)99.5 99.2 100.8 98.8 101 101.8 98.5 99 100.2

2.4 稳定性实验 将大鼠血浆样品按2.3方法处理，分别于0、2、4、6、10、12 h，按上述色谱条件进行测定。样品峰面积的RSD为3.25%，表明含药血浆在常温下12 h内稳定性良好。

2.5 大鼠血药浓度测定 取大鼠不同时间点的血浆样品，按照2.3方法处理，并依2.1色谱条件进行检测，计算不同时间点血浆中大黄酸的浓度，结果见表2。绘制血浆中药物浓度变化曲线，见图4。

表2 不同时间大鼠血浆大黄酸含量测定(n=6)

图4 大黄酸在大鼠血浆内药－时曲线(n=6)

3 讨论

大黄是清热解毒方的主要药物之一，本实验对大鼠口服清热解毒方后血浆中大黄酸含量经时变化进行观察，结果发现大黄酸吸收入血较快，代谢曲线呈单峰模式，说明这可能是清热解毒方制剂比中药汤剂起效快的原因所在。然而大黄酸只是其中的一个有效成分，中药复方非常复杂，要全面阐明全部化学成分的吸收，分布，代谢和排泄规律难度很大，但通过本次实验摸索，提示以高效液相色谱法来检测各有效成分的体内含量变化是便捷可行的，大黄酸的体内代谢的探讨为进一步开展复方药物代谢特征的研究奠定了基础。

[1]吴咸中.中西医结合急腹症方药诠释[M].天津：天津科学技术出版社,2001：340.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[Z].北京：化学工业出版社,2005：17.

[3]谢华,马越鸣,王天明,等.桃核承气汤及单味大黄中大黄酸在家兔体内的药代动力学[J].中药药理与临床,2005,21(2)：1.

[4]朱伟,张莉,王学美,等.健康志愿者口服大黄制剂后大黄酸在人体内的药代学研究[J].中国中药杂志,2005,30(18)：1458.

Ongoing Changes of Plasma Rhein Level in Mouse Tested by RP-HPLC

Xue Xiaoping,Lu Yanmin,Li Donghua,et alTianjin Institute of Acute abdominal Diseases by Integrated Traditional Chinese and Western Medi⁃cine,Tianjin(300100),china

ObjectiveTo observe the ongoing changes of plasma rhein level in mouse after orally taken QingReJieDu(清热解毒)decoction.MethodsThe RP-HPLC analysis was carried out with a Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column and a mobile phase of methanol-0.1%phosphoric acid solution(V：V=85：15).The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35℃,The detection wave length was set at 254 nm.ResultsOne hour after orally taken QingReJieDu decoction in mouse,the plasma rhein level reached a peak value,then decreased steadily and it was metabolized entirely in 12 hours.ConclusionThe ongoing changes of the content of rhein in mouse plasma can be shown by giving QingReJieDu decoction orally.This RP-HPLC is easy and fast to test the body content of some drugs,hence is suitably used in the study of metabo⁃lism features of some herbal medicine.

rhein,RP-HPLC,QingReJieDu prescription

R285.5；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0066-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.024

天津市科技攻关计划重大科技项目(05YFGDSFO2600)

天津市南开医院中西医结合急腹症研究所（天津 300100）

刘洪斌,Tel：(022)27435368;E-mail：jtss@sina.com

（收稿：2010-03-20 修回：2010-06-22）

（责任编辑 田在善）