NF-κB通路在TNF-α诱导胃癌细胞凋亡中的作用

刘静，徐玲，刘云鹏，曲秀娟，张晔，侯科佐

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤内科，沈阳 110001）

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居所有癌症死亡率的前3位。联合化疗是晚期胃癌的主要治疗手段，但总体疗效较差［1］。目前尚无高效低毒的治疗方案，新型抗肿瘤生物制剂仍需要进一步开发探索。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是最早发现的具有肿瘤杀伤活性的细胞因子，可诱导多种肿瘤细胞凋亡［2］。然而一些研究也显示，部分肿瘤细胞存在对TNF-α的天然或获得性耐药［3］。胃癌细胞对TNF-α的敏感性目前尚不清楚。本研究探讨了重组改构人TNF-α对胃癌细胞系的诱导凋亡作用，并探讨了核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路对其诱导凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

重组改构人TNF-α购自上海赛达生物药业有限公司；碘化丙锭（PI）购自Sigma-Aldrich公司；RNase A购自AMRESCO公司；Lipofectamine 2000试剂购自Invitrogen公司；RPMI 1640培养基，OPTIMEM购自Gibco公司；胎牛血清购自天津血液研究所；兔抗人NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB，IκBα），鼠抗人 tubulin 抗体购自 Santa Cruz公司；羊抗鼠和羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL试剂盒购于PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：人胃癌细胞株SGC7901为本实验室常规传代培养，生长于含有10%灭活胎牛血清，青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/ml）的RPMI 1640培养基中，于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱内培养。实验组细胞转染编码突变型IκB的cDNA（IκB D/N），对照组转染空载体。转染 48 h后分别予 100，1 000及 10 000 U/ml的 TNF-α处理，24 h后行凋亡分析。

1.2.2 MTT法测定细胞活力：细胞以1×105/ml的浓度接种于96孔板，孵育过夜后每孔加入不同浓度的TNF-α，孵育 24 h 后加入 20 ml MTT（5 mg/ml），继续孵育4 h。弃上清，每孔加入200 ml DMSO，振荡摇匀。用酶标仪于570 nm波长测定吸光度值。按照下列公式计算细胞活力：细胞活力=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡：细胞以3×105/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜后加入不同浓度的TNF-α，24 h后收集细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定过夜。PBS洗涤后加入20 mg/ml RNase A，37℃孵育 30 min，之后加入 10 mg/ml碘化丙锭（PI），避光孵育30 min。使用流式细胞术进行检测，WinMDI软件进行数据分析。

1.2.4 Western blot检测IκBα表达变化：收集细胞，冷PBS洗2次后加入1%Triton裂解液［1%Triton X-100，50 mmol/L Tris-Cl（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，2 μg/ml aprotinin］，冰上裂解 30 min，之后高速离心（15 000 r/min）30 min，取上清，Lowry法进行蛋白定量。将样品与3×样品缓冲液混合后，煮沸5 min，于12%的SDS-聚丙烯凝胶中电泳，之后电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜。TBST［10 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20］洗 4次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育30 min，TBST洗后，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统成像并分析处理。

1.2.5 瞬时转染：瞬时转染参照Lipofectamine 2 000试剂盒说明进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TNF-α对SGC7901细胞活力的影响

100，1 000 及 10 000 U/ml的 TNF-α 作用细胞24 h后，细胞存活率分别为（99.2±0.6）%，（92.0±2.7）%和（97.9±2.2）%。结果提示 SGC7901细胞对TNF-α高度耐药。

2.2 TNF-α对NF-κB通路活性的影响

10 000 U/ml TNF-α处理细胞5 min后，Western blot即可检测到IκB蛋白的降解，至15 min和30 min时IκB几乎完全消失，60 min以后逐渐恢复（图1）。这一结果提示在胃癌细胞中TNF-α可快速活化NF-κB 通路。

2.3 过表达突变型IκB对NF-κB通路活性的影响

将空载体或编码突变型 IκB 的 cDNA（IκB D/N）转染入 SGC7901细胞，48 h后加入 10 000 U/ml TNF-α 作用 30 min，Western blot结果显示 TNF-α 可降解转染空载体细胞的IκB，而突变IκB不能被TNF-α降解，提示在过表达突变型IκB的SGC7901细胞中，NF-κB通路活性已经被抑制（图2）。

2.4 抑制NF-κB通路活性对TNF-α诱导SGC7901细胞凋亡的影响

转染空载体的SGC7901细胞经10 000 U/ml TNF-α 作用 24 h后，仅（5.2±2.4）%细胞发生凋亡；而转染突变型IκB的细胞经TNF-α作用24 h后，凋亡细胞升至（21.8±2.9）%，明显高于转染空载体细胞（P<0.05）（图 3）。结果提示，抑制 NF-κB 通路的活性可以增强SGC7901细胞对TNF-α诱导凋亡的敏感性。

3 讨论

TNF-α作为最早发现的能杀伤肿瘤的细胞因子，在肿瘤的治疗中有很好的应用前景。然而一些肿瘤细胞对TNF-α诱导的凋亡具有耐药性。本研究中 100，1 000 及 10 000 U/ml的 TNF-α 作用于SGC7901细胞24 h，均不能有效抑制细胞增殖，提示胃癌细胞存在对TNF-α的天然耐药。进一步探讨耐药机制，是提高TNF-α抗肿瘤治疗疗效的前提。

NF-κB是一组转录因子，可促进多种靶基因的转录。在某些肿瘤细胞中，TNF-α可激活NF-κB通路，进而启动抗凋亡蛋白的转录，拮抗凋亡［4］。但是在某些肿瘤中，NF-κB活化并不拮抗TNF-α的诱导凋亡作用［5］。本研究结果提示，TNF-α可在短时间内诱导人胃癌细胞株SGC7901内NF-κB活化，过表达突变型IκB使NF-κB通路失活可明显增强胃癌细胞对TNF-α诱导凋亡的敏感性，提示在胃癌细胞中NF-κB通路主要起抗凋亡作用，抑制NF-κB活性可逆转细胞对TNF-α诱导凋亡的耐药。

除诱导凋亡之外，TNF-α也是强烈的促炎性因子，其诱导的炎性反应也与激活了NF-κB有关。近年来有关TNF的临床研究主要集中在局部给药方式方面，如肢体灌注、腔内灌注、瘤体局部注射等，主要是因为TNF全身用药可引起严重的毒副反应［6］。因而抑制NF-κB活性不仅可以增强细胞对TNF-α诱导凋亡的敏感性，还可以抑制TNF-α诱发的炎性反应，是提高TNF-α抗肿瘤疗效、减轻毒副反应的有效手段。

综上所述，本研究结果提示，胃癌细胞对TNF-α诱导的凋亡耐药机制可能与TNF-α激活了NF-κB通路有关。抑制NF-κB通路活性可有效逆转细胞对TNF-α诱导凋亡的耐药，NF-κB通路抑制剂与TNF-α联合应用有可能成为今后晚期胃癌的有效治疗措施。

［1］Liakakos T，Roukos DH.More controversy than ever– challenges and promises towards personalized treatment of gastric cancer［J］.Ann Surg Oncol，2008，15（4）：956-960.

［2］Gaur U，Aggarwal BB.Regulation of proliferation，survival and apoptosis by members of the TNF superfamily ［J］.Biochem Pharmacol，2003，66（8）：1403-1408.

［3］Tamada K，Chen L.Renewed interest in cancer immunotherapy with the tumor necrosis factor superfamily molecules［J］.Cancer Immunol Immunother，2006，55（4）：355-362.

［4］Burstein E，Duckett CS.Dying for NF-kappaB?Control of cell death by transcriptional regulation of the apoptotic machinery ［J］.Curr Opin Cell Biol，2003，15（6）：732-737.

［5］Ryan KM，Ernst MK，Rice NR，et al.Role of NF-κB in p53-mediated programmed cell death［J］.Nature，2000，404（6780）：892-897.

［6］刘洁凡，曾谦，吴兰豹.重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性胸腔积液 39 例分析［J］.中国药物与临床，2005，5（11）：872-873.