dBcAMP通过上皮生长因子受体间接激活诱导星形胶质细胞形态变化

李红梅，杨晓临，彭亮

（中国医科大学 药学院临床药理学教研室，沈阳 110001）

星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种，约占脑细胞容量的40%。研究表明，胶质细胞在脑组织损伤或缺血时发生激活现象，表现为细胞体积变大、数量增多和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达增加等一系列形态和功能的变化［1］。了解星形胶质细胞分化的调节机制至关重要。研究表明，提高细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）浓度能够诱导星形胶质细胞的形态变化，因此常用作星形胶质细胞形态分化的研究模型［1］。本研究应用免疫细胞化学技术观察了细胞膜渗透型的cAMP类似物双丁酰环腺苷酸（dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，dBcAMP）诱导的星形胶质细胞形态变化，并进一步探讨其信号传导通路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：马血清购自GIBCO公司；DMEM培养基、dBcAMP和Anti-GFAP购自Sigma公司；GM6001和AG1478购自Calbiochem公司；羊抗兔IgG-FITC购自Santa Cruz公司。

1.1.2 动物：CD-1小鼠，雌、雄两性，体质量30～40 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代星形胶质细胞培养及分组：星形胶质细胞取材于新生CD-1小鼠大脑皮质。无菌操作，断头剥离脑膜后，取出脑组织。显微镜（SZ6045 OLYMPUS，日本）下分离出大脑皮质，将其切碎至1 mm3以下组织块移入离心管中，涡旋器上充分振荡1 min，分别过100 μm和70 μm滤膜。将细胞混悬液种植在含有盖玻片的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中孵育。通常1个小鼠大脑可以铺10个35 mm培养皿。使用含有7.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基（8.3 g/L DMEM，2.0 mmol/L L-Glutamine，7.5 mmol/L葡萄糖，1.25 mmol/L丙酮酸钠，44 mmol/L碳酸氢钠，0.042 mmol/L酚红），初始为含20%马血清的DMEM培养基，每3 d更换1次新鲜培养基，第3次更换的培养基马血清浓度降为10%，培养2周。将原代培养2周的细胞分为6组，并分别孵育72 h：（1）dBcAMP 组：加入 0.25 mmol/L dBcAMP；（2）dB－cAMP+AG1478组：1 μmol/L上皮生长因子受体（epidermal growth factor recepter，EGFR）特异性拮抗剂AG1478刺激15 min后，再加入0.25 mmol/L dB－cAMP，独立的实验重复 2 次；（3）dBcAMP+GM6001组：加入10 μmol/L金属蛋白酶组织抑制剂GM6001 15 min后，再加入0.25 mmol/L dBcAMP，独立的实验重复 2 次；（4）AG1478 组：加入 1 μmol/L AG1478；（5）GM6001 组：加入 10 μmol/L GM6001；（6） 对照组：未加任何处理因素。

1.2.2 免疫细胞化学技术：用冷PBS（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO3·12H2O，2 mmol/L KH2PO3，1 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgCl2和7.5 mmol/L glucose，pH 7.4）轻轻冲洗细胞后，加入纯甲醇-20℃固定6 min。再用PBS冲洗细胞，加入含山羊血清的0.3%Triton X-100 PBS溶液封闭30 min后，加入GFAP特异性抗体（1∶100稀释），4℃过夜，PBS冲洗3次，每次10 min。然后加入羊抗兔IgG-FITC（1∶100稀释）孵育 2 h，4℃避光，PBS冲洗3次，每次10 min。50%甘油封片后荧光显微镜（BX51 OLYMPUS，日本）观察。

2 结果

2.1 dBcAMP诱导星形胶质细胞发生形态变化

通过免疫荧光鉴定星形胶质细胞，显微镜下放大400倍观察GFAP免疫反应阳性细胞的形态。结果如图1所示，对照组星形胶质细胞胞体较小，呈多角形，胞膜光滑，边界清楚，突触也较短。经0.25 mmol/L dBcAMP处理的星形胶质细胞形态发生明显改变，胞体由多角形转变为星形，突触增长并相互交织成网状。

2.2 dBcAMP通过上皮生长因子受体间接激活引起星形胶质细胞形态变化

dBcAMP+AG1478组细胞与对照组形态相似，胞体呈多角形，提示AG1478抑制了dBcAMP诱导的星形胶质细胞形态变化（图2）。表明dBcAMP可通过上皮生长因子受体的间接激活引起此形态变化过程。

2.3 金属蛋白酶参与dBcAMP引起的星形胶质细胞形态变化

dBcAMP+GM6001组细胞与对照组形态相似，胞体呈多角形（图3），提示GM6001抑制了dBcAMP诱导的星形胶质细胞形态变化。表明金属蛋白酶参与此形态变化过程。

3 讨论

星形胶质细胞在脑组织损伤或缺血时可发生细胞体积变大、数量增多和GFAP表达增加等一系列形态和功能的变化［2］。反应性星形胶质细胞的增多可能是为了满足星形胶质细胞代谢活动的增加。GFAP表达量的增加反映了星形胶质细胞的增生和发育，在神经元损伤后的修复保护中有重要意义［3］。Friedberg［4］认为星形胶质细胞的活化可以作为脑损伤的证据。因此，了解星形胶质细胞分化的调节机制至关重要。本研究应用免疫细胞化学技术观察了dBcAMP诱导的星形胶质细胞形态变化，并进一步探讨其信号传导通路。

上皮生长因子受体广泛存在于脑内［5］，星形胶质细胞表达该受体的ErbB1及ErbB4亚型。上皮生长因子受体间接激活是近年来发现的细胞内/外信号传导途径，是细胞根据外界刺激调节自身及其周围神经元功能的一种巧妙方式，也是星形胶质细胞调节与其相邻的神经元增生、分化、生长等效应的关键环节。经典的上皮生长因子受体间接激活的信号传导途径为［6］：Gi蛋白耦联受体激活之后，由三合体Gi蛋白的βγ亚单位激活细胞内金属蛋白酶，在后者的作用下上皮生长因子家族成员由细胞膜表面脱落释放于细胞外液，与细胞自身与邻近细胞的EGFR结合，导致其发生磷酸化，从而激活细胞内Ras蛋白激酶-丝裂原激活蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3激酶信号传导通路。我们早期的研究结果表明，在原代培养的星形胶质细胞，右旋美托咪啶可通过上皮生长因子受体间接激活诱导细胞外调节蛋白激酶的磷酸化［7，8］。

Haghighat等［9］的研究表明，在大鼠原代培养的星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞，dBcAMP作用24 h后能够引起细胞形态发生变化。本研究发现，dB－cAMP能够引起原代培养的星形胶质细胞由多角形转变为星形，且这种形态变化能够被上皮生长因子受体特异性拮抗剂AG1478所抑制；同时，这种形态变化也能够被金属蛋白酶组织抑制剂GM6001所阻断。本实验结果提示，dBcAMP通过激活细胞内金属蛋白酶，进一步导致上皮生长因子受体自身磷酸化，从而诱导星形胶质细胞的形态变化。

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