FMRP影响小鼠小脑皮质神经元发育与迁移的实验研究

孙晓红，董玉霞，冯昱，宋卫科，何悦，何志义

（中国医科大学 1.附属第四医院神经内科，沈阳 110032；2.附属第一医院神经内科，沈阳 110001）

脆性X智力障碍蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）是脆性X智力障碍1（fragile X mental retardation 1，Fmr1）基因的编码产物，Fmr1 基因（CGG）区扩增突变导致该基因沉默致使FMRP不表达或低表达［1，2］，是导致脆性 X 综合征（fragile X syndrome，FXS）的主要原因。目前研究发现，20%～30%FXS患者伴癫痫发作［3］，因此，小脑中调节神经兴奋性的谷氨酸（glutamatergic acid，Glu）和γ氨基丁酸（gamma aminobutyric acidergic acid，GABA）神经核团的形态与功能的变化，成为FXS发病机制的研究热点。本实验旨在通过对胚胎发育期小鼠小脑神经元形态学的研究探讨FMRP缺失对小脑神经元发育迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 质粒构建、转染及FXS阳性小鼠类型鉴定

将I304N错译突变基因插入全长的哺乳动物Fmr1cDNA，构建FMRPmutant-pEGFP与pEGF质粒；将质粒转染入胚胎小鼠侧脑室，转染浓度为pEGFP 1.3 μg/μl，FMRPmutant-pEGFP 1.3 μg/μl；并对鼠尾组织进行PCR鉴定小鼠基因型，具体操作步骤见前期实验［4］。pEGFP组为对照组，FMRPmutantpEGFP为实验组。

1.2 脑组织取材与染色

胚胎17 d对小鼠小脑组织进行取材，4%多聚甲醛固定过夜，脱水透化处理后制成蜡块，切片机切成20 μm的冠状切片。分别进行Nissl染色及免疫荧光染色，免疫荧光染色所用一抗为兔抗GFP（1∶500），兔抗 Tbr2（1∶2 000）；二抗为 Alexa Fluor-488山羊抗兔（1∶1 000）。

1.3 图像获取及数据分析

用连有Olympus BX51荧光共聚焦显微镜的MicroFire S099808的数码相机获取高分辨率的图片，Image-Pro Plus version6进行图像分析。

2 结果

2.1 Nissl染色观察小脑深部核团与浦肯耶细胞（Purkinje cell，PC）

大体标本观察到实验组胚胎小鼠小脑较对照组略小，冠状切片尼氏染色显示，对照组小鼠小脑细胞较大而圆，排列整齐，位于外颗粒层与内颗粒层间形成PC细胞层（图1A），而实验组PC较小，呈现非极性紊乱排列，核仁固缩浓染等特征，部分细胞滞留于内层颗粒细胞层而无法正常移行入PC细胞层（图1B）。小脑深部核团（deep cerebellar neuclei，DNC）包括3种核：顶核、中间核和齿状核，Nissl染色显示对照组小鼠小脑中间核和齿状核核排列紧密，无明显界限（图1C），而实验组中间核和齿状核核体积缩小，核团间彼此分离，被白质（white matter，WM）分隔（图1D）。

2.2 免疫荧光染色观察小脑单极刷状缘细胞表达及分布

T 盒转录因子（T-box transcription factor，Tbr2）是单极刷状缘细胞（unipolar brush cell，UBC）标志物。免疫荧光染色显示Tbr2标记的UBC阳性细胞主要分布在小脑侧脑室区（ventricular zone，vz），对照组Tbr2阳性细胞分别从菱唇（rhombic lip，rl）与外颗粒层途经白质形成两条迁移路径（图1E），而实验组Tbr2阳性细胞仅存在由从菱唇经白质一条迁移路径，并在小脑侧脑室区异常聚集（图1F）。

3 讨论

小脑主要包含两大类功能性核团：谷氨酸盐神经元和γ氨基丁酸盐神经元，小脑皮质发育过程中这两类神经元发育迁移等形态学变化影响着小脑兴奋性功能通路与抑制性功能通路的平衡［5］。谷氨酸盐神经元包括 DNC、UBC 及颗粒细胞（Granule），γ氨基丁酸盐神经元包括PC和抑制性中间神经元。

实验结果表明对照组小鼠小脑中间核和齿状核核排列紧密，无明显界限，而实验组中间核和齿状核核体积缩小，核团间彼此分离，被白质分隔，提示FMRP缺乏时小脑新皮质神经元前体细胞生成及移行异常，可能是导致FXS患者认知障碍及行为异常的原因之一；Tbr2是发育小鼠小脑内UBC标志物［6］，Tbr2阳性细胞在侧脑室区异常聚集与迁移路径的改变提示小脑内谷氨酸盐神经元的生成和迁移出现异常［7］。此外，实验组PC呈现非极性紊乱排列，核仁固缩浓染等特征，部分细胞滞留于内层颗粒细胞层而无法正常移行入PC细胞层，提示FMRP缺失可能对PC产生影响导致FXS患者癫痫症状的发生［8］。

综上，本实验发现FMRP缺失时小脑兴奋性及抑制性两类神经元的发育迁移均出现异常，这有助于进一步探讨FXS患者和Fmr1基因敲除小鼠认知障碍和癫痫的发生机制，为早期预防与治疗提供实验依据。

［1］JinP，WarrenST.NewinsightsintofragileXsyndrome：From molecules to neurobehaviors［J］.Trends Biochem Sci，2003，28（3）：152-158.

［2］Ramos A，Hollingworth D，Pastore A.The role of a clinically important mutation in the fold and RNA-binding properties of KH motifs［J］.RNA，2003，9（3）：293-298.

［3］Garber K，Smith KT，Reines D，et al.Transcription，translation and fragile X syndrome［J］.Curr Opin Genet Dev，2006，16（3）：270-275.

［4］孙晓红，董玉霞，冯昱，等.FMRP促进胚胎小鼠大脑皮层神经元发育与迁移［J］.解剖科学进展，2010，16（3）：200-203.

［5］Bear MF，Huber KM，Warren ST.The mGluR theory of fragile X mental retardation［J］.Trends Neurosci，2004，27（7）：370-377.

［6］Englund C，Fink A，Lau C，et al.Pax6，Tbr2，and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia，intermediate progenitor cells，and postmitotic neurons in developing neocortex［J］.J Neurosci，2005，25（1）：247-251.

［7］Mathis L，Nicolas JF.Progressive restriction of cell fates in relation to neuroepithelial cell mingling in the mouse cerebellum［J］.Dev Biol，2003，258（1）：20-31.

［8］Hoshino M，Nakamura S，Mori K，et al.Ptf1a，a bHLH transcriptional gene，defines GABAergic neuronal fates in cerebellum［J］.Neuron，2005，47（2）：201-213.