计算机辅助的小鼠肾连接小管三维重建

林庚，任昊，陈雪，翟效月

（中国医科大学 1.基础医学院组织胚胎学教研室；2.临床医药学院医学基础教学中心，沈阳 110001）

肾连接小管（connecting tubule，CNT）是肾单位和集合管系的过渡部位。从发生上，CNT既不属于肾单位起源，也不属于集合管系起源。小管和集合管的连接方式有种属差异，在兔和猪，几乎所有CNT先连接到弓形管，然后弓形管再与集合管相连；而在沙鼠，仅仅来自于最深层皮质的CNT通过弓形管连接到集合管；人和大鼠则介于两种之间，即起于浅表皮质的CNT常常直接将远曲小管连于集合管，而起于中间或深层皮质的CNT常常在皮质迷路中互相吻合成弓形管并上行，再在浅表皮质连接到集合管［1］。在走行上，CNT也与分泌肾素的入球微动脉有毗邻关系［2］。微细结构和功能研究显示，多数种属CNT由4种细胞成分组成：远曲小管细胞、主细胞、闰细胞（集合管上皮细胞），以及CNT自身特征细胞，即CNT细胞［3］。其中，CNT细胞贯穿CNT全长。因此，CNT兼具远曲小管和集合管的功能，同时又有它自身CNT细胞的重要功能，即K+的分泌和Na+的重吸收，其功能受肾上腺皮质激素的调节。此外，免疫细胞化学技术显示，CNT细胞上存在激肽释放酶，具有扩张血管的功能［4～6］。

本研究采用小鼠肾从皮质到髓质的连续半薄切片，通过计算机图像分析及三维重建技术，对来自皮质不同水平的具有不同髓袢长度的肾单位和集合管的过渡部分，即连接小管走行进行追踪，测量其长度，为小管上皮转运功能的研究提供形态学基础。

1 材料与方法

1．1 肾组织的制备

肾组织取自3只C57/BL/6J小鼠，体质量为25 g。腹主动脉灌流固定（1%戊二醛和4%的羟乙基淀粉，0.06 mol/L的二甲砷酸钠缓冲液配制，蔗糖调至300 mOsm，pH值7.4）。垂直于肾长轴取组织块，锇酸后固定1 h，梯度乙醇丙酮脱水后树脂812包埋。采用超薄切片机及钻石刀进行半薄切片，从肾被膜到肾乳头，共获2.5 μm厚的连续切片2 000张，通过甲苯胺蓝染色显示组织微细结构。

1．2 显微镜下图像获取与配准

应用“计算机-显微镜-数码相机”图像采集系统（Olympus AX 70显微镜；Olympus DP 50相机，东京，日本），每隔1张切片进行拍照，图像大小为2 596×1 889像素，每个像素相当于1.16 μm×1.16 μm。通过比较相邻两幅图像内生理对应点的像素灰度值的相似性来确定一幅图向相邻图平移及旋转，从而实现图像配准［7，8］。简言之，首先得出相邻两幅图的相对变换值（平移距离和旋转角度），再通过求相对变换值的相加函数得出系列图像中的每幅图的绝对变换值。图像配准过程在计算机Windows平台上操作。

1．3 CNT走行的追踪与长度测量

肾CNT的追踪和长度测量是在计算机Linux平台上通过C语言设计的系列程序实现的。肾小管走行的追踪始于肾小球尿极，终止于集合管在内外髓交界处。本研究追踪了来自3个小鼠肾的38个肾单位，与6个集合管相连。通过肾单位的全程追踪确立CNT来自于肾单位的种类。追踪过程自动生成一个数据文件，记录追踪小管走行的空间坐标，基于此坐标集，CNT走行的毗邻关系分析，以及CNT长度测量等得以实现。CNT走行的分析以加入同一条集合管的CNT为1组。CNT长度测量始于远曲小管高锥体细胞移行为立方上皮且细胞种类多样性之处，终止于CNT与另1条CNT或与弓形管或与集合管相连为止。测量运用欧几里德算法，即累加沿CNT走行的每两个连续点的距离。公式如下：

2 结果

2．1 肾CNT走行

结果如图1所示，在皮质髓放线中，每条集合管在皮质浅层共接收6～7个肾单位的CNT。其中1或2条为长髓袢肾单位（long loop nephron，LLN），其余5～6条为短髓袢肾单位（short loop nephron，SLN）。来自于LLN的CNT起自位于皮质深层或中层的远曲小管末端，在中层和浅层皮质迷路内弓状上行，形成弓形管［1］，途中有来自于浅表或中层皮质的SLN的CNT加入。最终，弓形管在浅层皮质近被膜处返折，返折后不再有CNT加入，并移行为集合管。来自于SLN的CNT除了在自身起源的肾小体附近的皮质迷路内上行，并与弓形管汇合，也有少数来自于最浅层皮质SLN的CNT在近被膜下直接与集合管相连。但是，走行在被膜下的连接小管一般不直接接触被膜，其间隔常常是一条近端小管。几乎所有集合管从浅表皮质到髓质不再接收CNT。在皮髓质交界处集合管开始与相邻集合管汇合。

2．2 CNT 长度

来自于不同肾单位的CNT走行长度差异很大，很难用平均值来表示，尤其是来自于深层皮质肾单位的CNT和弓形管。来自于浅表和中层皮质SLN的CNT长度范围为150～500 μm，而来自于深层或中层皮质LLN的CNT上升形成的弓形管长度范围为 700～1 200 μm。

3 讨论

20世纪80年代之前，肾微细结构的三维研究主要采用对连续二维显微图像的描述。由于这种传统的三维重建微细结构的研究方式耗时且工作量繁重，研究过程枯燥，加之肾单位肾小管走行复杂，限制了建立完整肾单位的数量，研究常常仅限于肾组织结构局部，如肾皮质、肾外髓、肾内髓等［7］，更无法确定CNT走行的确切长度。所以到目前为止，还没有CNT的走行研究是建立在长、短髓袢肾单位种类已确定的前提下，而只是根据肾小体在皮质中的位置来分析CNT［9］。这样，对分析CNT和其所在肾单位功能的连续和相互影响上构成局限性。本研究利用先进的显微镜配上高分辨率的数码相机，加上大存储量、高运算速度，以及图像处理功能强大的计算机，使得追踪完整肾单位走行的效率大大提高。我们将二维的切片在利用相关设备的辅助下变为三维可视化，从而更加有利于对肾单位亚节段的准确定位，在此基础上，根据髓袢长短分类肾单位和分析CNT走行及测量其长度得以实现。此外，本研究通过建立CNT三维走行更为进一步的细胞转运体分布的研究奠定基础［10］。

研究结果表明，小鼠CNT走行和大鼠及人的CNT走行相似［2］，即LLN的CNT起于肾皮质深层，在皮质迷路内上行，沿途与来自皮质中层或浅层的SLN的CNT汇合形成弓形管，后者再在皮质近被膜处返折并与集合管相连。只有小部分最浅表皮质的肾单位CNT直接在近被膜处返折，再与集合管系统直接相连。值得注意的是，集合管仅仅在浅表皮质与CNT或弓形管相连，此后的走行途中没有肾单位的CNT加入，提示来自集合管起始部位的肾单位滤液成分在集合管内不会因其他滤液的加入而被改变或稀释，而只有集合管自身的重吸收功能对它产生影响。研究还发现，CNT很少直接与被膜接触，总是有1～2条近端小管相隔，这样为在肾被膜下CNT微穿刺技术研究带来了困难。此外，根据目前被普遍接受的“肾脏结构的命名标准”［11］，集合管在皮质最浅层是分叉的，分叉的部分被称为“集合小管”，而不是集合管。但是，由于CNT的细胞组成兼具远曲小管和集合管细胞成分，CNT末端可能只有集合管的两种细胞和CNT细胞，所以本研究在不做免疫细胞化学及超微结构研究的前提下是不能确定具体集合管或集合小管起始位置，只能按“肾脏结构的命名标准”，把CNT在近被膜下返折部分看成是集合管系统的起始部，并以此为基础测量其走行长度。

CNT不仅仅是肾单位和集合管的连接或过渡部位，更是通过激素及体液调节肾脏离子和水转运等生理功能的重要部分。但是，CNT在胚胎发生中起源于哪种细胞成分和如何过渡为成熟CNT，以及组成CNT的4种细胞成分的比例如何，CNT走行与功能的关系，与血管的毗邻关系，与肾上腺皮质激素的关系等都有待进一步研究。

综上，本研究在计算机辅助下建立了两种髓袢肾单位的CNT在肾皮质的走行方式和距离，以及与集合管系统的过渡，为进一步通过细胞转运体的定位来分析CNT和集合管的细胞重吸收功能奠定了形态学基础。

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