胃癌细胞对三氧化二砷的敏感性与活性氧产生的关系

张敬东，佟晓光，刘云鹏，侯科佐，于萍，曲秀娟

（中国医科大学 附属第一医院 1.肿瘤内科；2.妇科，沈阳 110001）

砷剂的药物学作用在祖国医学中已有悠久的历史，我国学者应用三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）治疗初治与复发的急性早幼粒细胞白血病，患者达到完全缓解［1］，取得良好的疗效，同时无明显的不良反应及轻微骨髓抑制。低浓度砷剂诱导肿瘤细胞凋亡与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生有关［2，3］。本研究通过 As2O3作用 3种不同的胃癌细胞系，研究不同胃癌细胞系对As2O3的敏感性差异与细胞内在的ROS水平及ROS水平变化之间的关系，探讨As2O3对胃癌细胞系的杀伤与ROS的关系，为As2O3的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试剂：0.1%的As2O3，哈尔滨伊达药业有限公司生产；甲基偶氮唑蓝（MTT）、2′，7′-二氯乙酰乙酸盐荧光素（DCFH-DA），购于DAKO公司。DCFHDA，用95%乙醇溶解浓度为5 mmol/L，避光4℃保存，使用前用PBS稀释成终浓度10 μmol/L。

1.2 细胞培养

低分化胃黏液腺癌细胞株MGC803和BGC823、中分化腺癌细胞株SGC7901为本实验室常规传代培养，均生长于含有10%热灭活胎牛血清、12 U/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养，用终浓度0.25%的胰酶消化传代，实验选用对数生长期细胞。

1.3 MTT法进行细胞活力检测

取对数生长期细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔平底培养板，培养12h后加入0.1，0.5，2，5，10，25，50 μmol/L 的 As2O3，设立空白对照，每组取3个重复孔。继续孵育24，48，72 h后每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，再培养4 h后吸去全部上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振荡摇匀。置酶标仪上于570 nm波长下测吸光度，按下列公式计算增殖率：增殖率=（处理组平均吸光度值-空白对照平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值-空白对照平均吸光度值）×100%。每组实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测细胞内ROS水平

取对照及 5 μmol/L As2O3作用 24 h的胃癌MGC803、BGC823和 SGC7901细胞，用 PBS洗 2次，1 000 r/min离心5 min，去上清，每管加入10 μmol/L的DCFH-DA 1 ml。37℃避光恒温水浴40 min，1 000 r/min离心10 min，去上清后加PBS 500 μl，用流式细胞仪测定DCFH-DA被细胞内H2O2氧化为 2′，7′-二氯荧光素 （2′，7′-dichlorofluorescein，DCF），DCF能发出绿色荧光，其荧光强度可反映细胞内ROS的总体生成水平［4］。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 As2O3抑制胃癌细胞系的增殖

不同浓度的 As2O3作用于胃癌 MGC803、BGC823和SGC7901细胞24～72 h，结果显示As2O3呈时间、浓度依赖性抑制3种胃癌细胞的增殖，72 h抑制细胞增殖的IC50分别为2.8，3.1和10.2 μmol/L，与对照组比较均有显著差异（P<0.01）。胃癌MGC803和BGC823细胞72 h的IC50均明显低于SGC7901细胞（P均<0.01）。见图1。

2.2 细胞内在ROS的水平

MGC803、BGC823和SGC7901细胞在未用药时ROS 峰值水平分别为 20.3±2.0、64.2±3.3 和 57.7±2.0（图2）。BGC823细胞未用药时的内在ROS水平最高，SGC7901次之，MGC803细胞最低，而胃癌MGC803、BGC823细胞对As2O3的敏感性均明显高于SGC7901细胞，内在ROS的水平不能反映胃癌细胞对As2O3的敏感性。

2.3 As2O3作用后细胞ROS产生的变化

5 μmol/L As2O3作用 24 h 后，MGC803、BGC823和SGC7901细胞内ROS峰值水平分别为100.8±3.8、103.5 ±2.3 和 56.5 ±2.4，MGC803、BGC823 细 胞 的ROS峰值水平与用药前比较明显增高（P<0.001，P<0.01），而SGC7901细胞未见明显的升高峰（P>0.05）。而3种细胞系中SGC7901细胞72 h的IC50是其他2种细胞的3～4倍，对As2O3的敏感性低于其他2种胃癌细胞，肿瘤细胞对As2O3的敏感性与As2O3作用后ROS的升高有关。见图3。

3 讨论

As2O3对初治及复发的急性早幼粒细胞白血病具有较好的疗效［1］，体外实验表明As2O3同时对多种实体瘤细胞均有杀伤作用，主要机制为诱导肿瘤细胞凋亡［2，3，5～7］。近年来研究表明，多种抗肿瘤药等被证实通过 ROS 产生引起凋亡［2，3，8～10］。ROS 是真核细胞有氧呼吸过程中形成的，它包括H2O2、超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH）、一氧化氮（NO）等，其中H2O2具有较强的氧化性，是ROS的主要成分之一，可以反映总体ROS水平。

As2O3作为新的凋亡诱导剂，有文献报道主要通过ROS 的产生，尤其是 H2O2诱导肿瘤细胞凋亡［3，8～10］。也有文献报道肿瘤细胞对As2O3的敏感性与细胞内在固有ROS水平有关［11］。As2O3诱导消化道肿瘤细胞凋亡的机制与线粒体膜电位降低、ROS产生有关，肿瘤细胞对As2O3杀伤的敏感性与ROS的关系仍不清楚。

本研究对3种胃癌细胞系进行比较研究，结果显示As2O3对3种胃癌细胞系均有杀伤作用，但MGC803和BGC823细胞对As2O3的敏感性明显高于SGC7901细胞。而内在ROS水平以BGC823细胞最高，SGC7901细胞次之，MGC803细胞最低，因此胃癌细胞对As2O3的敏感性与内在ROS水平无明显相关性。而Yi等［11］应用两对4种细胞系进行两两比较，认为As2O3的敏感性与细胞内在ROS水平相关，与我们的研究结果不同，可能与选择的细胞系的种类及数量不同有关。我们应用3种胃癌细胞系比较不同细胞系间的差别。在As2O3作用24 h后MGC803和BGC823细胞的ROS水平均有明显升高，而SGC7901细胞未见升高，胃癌细胞对As2O3的敏感性可能与ROS的产生有关，提高细胞内ROS的水平能够增加As2O3诱导的细胞凋亡，细胞内ROS水平的变化可能与细胞对As2O3的敏感性更相关［3，8～10］。

本研究结果显示，胃癌细胞系对As2O3的敏感性与ROS的变化程度有关，与内在ROS水平无明显相关，为As2O3的临床应用提供了参考。

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