曲古抑菌素A对人卵巢癌细胞系A2780细胞周期的影响

马晓欣，赵冬妮，金英楠，苗青

（1.中国医科大学 附属盛京医院妇产科，沈阳 110004；2.北京市西城区疾病预防控制中心 生殖保健科，北京 100029）

表达遗传学在不改变基因序列的情况下，通过DNA甲基化、组蛋白共价修饰使基因表达发生可遗传改变，是肿瘤发生的主要原因之一。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）源自链霉菌代谢产物，具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）的特征，能通过 Zn2+螯合作用特异、可逆的抑制哺乳动物组蛋白去乙酰辅酶活性，诱导肿瘤细胞周期阻滞、分化及凋亡。细胞周期素依赖激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）p21WAF/CIPI与细胞周期密切相关，目前研究表明，p21WAF/CIPImRNA转录、蛋白表达的变化是卵巢癌发生、发展的因素之一［1］。本实验以人卵巢癌细胞系A2780为靶细胞，通过检测细胞周期和p21WAF/CIPImRNA的表达，探讨TSA对人卵巢癌A2780细胞的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞系A2780由中国医科大学细胞生物教研室惠赠。TSA购自美国Sigma公司，胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司，RNase酶、碘化丙锭购自美国Sigma公司，Trizol Reagent购自美国GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将A2780细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中贴壁传代培养。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期变化：取对数生长期A2780细胞，分为A、B两组。A组细胞在100 nmol/L 的 TSA 下分别培养 6，12，24，36，48 h；B 组细胞分别在 0，50，100，200，400 nmol/L 的 TSA 下培养24 h。收集细胞，以75%乙醇固定，加入10 μl RNaseA（10 μg/ml），置于 37℃水浴 30 min 后以 200 μl碘化丙锭（100 μg/ml）染色，4℃避光染色 30 min，300目筛网过滤后上流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.2.3 RT-PCR检测p21WAF/CIPImRNA的表达：收集并分离经上述方法培养后的细胞1×107个，加Trizol裂解液，提取总RNA，按照逆转录试剂盒手册操作，合成cDNA。逆转录反应条件：65℃1 min，30℃5 min，15～30℃内匀速升温，65℃ 30 min，98℃ 5 min，5 ℃ 5 min；PCR 扩增：β-actin 引物序列：Upward primer：5′GGCATCGTGATGGACTCC 3′；Downward primer：5′GCTGGAAGGTGGACAGCG 3′；产物长度620 bp。 p21WAF/CIPI引 物 序 列 ：Upward primer：5′GAGCCCAGACGTTATTCT 3′；Downward primer：5′AGTCCCACAACTGCCTAT 3′；产物长度 136 bp。PCR反应条件：94℃变性3 min后，以94℃45 s，51.5℃1 min，72℃1 min的顺序循环35次，最后72℃延伸7 min。以β肌动蛋白（β-actin）为内对照检测转录效率。产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像。p21WAF/CIPI的表达以所测产物的条带强度与内参对照β-actin条带强度的比值来表示。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TSA作用不同时间对A2780细胞周期分布的影响

流式细胞仪检测结果显示，A组细胞随着药物作用时间延长，G2/M期细胞增加，S期细胞减少，于36 h达到顶峰，各时间组间比较见表1。

表1 100 nmol/L TSA在不同时间作用于A2780的细胞周期变化及p21WAF/CIPImRNA的表达（±s）Tab.1 Effect of 100 nmol/L TSA on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

表1 100 nmol/L TSA在不同时间作用于A2780的细胞周期变化及p21WAF/CIPImRNA的表达（±s）Tab.1 Effect of 100 nmol/L TSA on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

1）P<0.05 vs 12 h group；2）P<0.05 vs 6 h group；3）P<0.05 vs 24 h group；4）P<0.05 vs 36 h group

Time of TSA treatment（h） G0/G1 G2/M S Expression ofp21WAF/CIPImRNA 6 70.017±3.140 10.253±2.847 19.063±2.215 2.556±0.333 12 72.677±2.426 12.013±1.743 15.310±1.8342） 3.322±0.1562）24 69.623±1.708 20.043±1.8951），2） 10.167±0.2581），2） 4.755±0.3891），2）36 66.727±1.496 27.913±1.7881），2），3） 5.360±1.8091），2），3） 4.313±0.7061），2）48 65.963±1.9571） 28.380±0.8581），2），3） 5.657±1.7351），2），3） 2.801±0.1493），4）

2.2 TSA作用不同时间对A2780细胞p21WAF/CIPI mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，A组细胞于12 h开始出现p21WAF/CIPImRNA表达水平的升高，并随作用时间延长而变化，于24 h达到顶峰，48 h开始表达出现下降，各时间组间比较有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 不同浓度的TSA对A2780细胞周期分布的影响

流式细胞仪检测结果显示，B组细胞于100 nmol/L开始，随着药物浓度的增加G2/M期细胞增加，S期细胞减少，各浓度组间比较见表2。

2.4 不同浓度TSA对A2780细胞p21WAF/CIPImRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，B组细胞于100 nmol/L开始，p21WAF/CIPImRNA的表达水平增高，并随着药物浓度的增加而升高，各浓度组间比较见表2。

3 讨论

目前认为，表遗传修饰紊乱是肿瘤发生的主要原因之一。乙酰化是组蛋白共价修饰主要形式，受组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HAT）和去乙酰化酶（histone deacetylases，HDAC）调节，HAT可使组蛋白乙酰化，激活转录，HDAC则抑制转录。组蛋白乙酰化和去乙酰化在基因的转录调控中发挥着重要作用，蛋白乙酰化水平由组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的动态平衡调节［2］。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylaseinhibitors，HDACI）主要包括 TSA、丁酸（butyric acid，BA）、丙戊酸（valproic acid，VPA）等。HDACI通过提高组蛋白乙酰化水平而从染色质水平调节特定基因的表达，诱导肿瘤细胞周期阻滞和分化，诱导细胞发生凋亡［3］。以HDACI处理体外培养肿瘤细胞可引起G1或G2/M期阻滞。且HDACI具有选择性肿瘤毒性，造血系统不受影响或仅受轻微影响，在动物实验中显示其发挥作用的剂量仅产生较弱的毒副作用，目前已有多种HDACI进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验，展现出良好的应用前景［4］。

表2 不同浓度TSA对A2780细胞作用24 h细胞周期变化及p21WAF/CIPImRNA的表达（±s）Tab.2 Effect of different concentrations of TSA treatment for 24 h on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

表2 不同浓度TSA对A2780细胞作用24 h细胞周期变化及p21WAF/CIPImRNA的表达（±s）Tab.2 Effect of different concentrations of TSA treatment for 24 h on the cell cycle andp21WAF/CIPImRNA expression in A2780 cells（±s）

1）P<0.05 vs 0 nmol/L group；2）P<0.05 vs 50 nmol/L group；3）P<0.05 vs100 nmol/L group；4）P<0.05 vs 200 nmol/L group；

Group（TSA concentration，nmol/L） G0/G1 G2/M S Expression ofp21WAF/CIPImRNA 0 59.250±4.015 4.573±0.354 36.177±3.691 1.523±0.447 50 64.900±3.650 5.283±1.028 29.817±2.8401） 2.122±0.356 100 69.197±4.6801） 11.043±1.6031），2） 19.760±3.1391），2） 3.451±0.2601），2）200 67.250±2.8101） 23.003±1.5541），2），3） 9.747±1.2861），2），3） 5.428±0.7251），2），3）400 64.320±2.447 32.177±2.5801），2），3），4） 3.503±0.5061），2），3），4） 5.494±0.4841），2），3）

曲古抑菌素A是HDACI中比较有代表性的一种。研究发现，TSA能有效激活基因表达、抑制细胞增殖、引起细胞分化或调亡［5］。

本研究检测TSA对人卵巢癌细胞A2780凋亡情况的影响时发现，TSA作用后G2/M期细胞增加，S期细胞减少，且该作用随着药物浓度和作用时间的改变而逐步变化。该结果表明，曲古抑菌素可有效作用于细胞周期，使细胞停滞在G2/M期，减少DNA的复制，进而阻碍了细胞分裂。同时，曲古抑菌素以时间和剂量依赖的形式诱导卵巢癌细胞发生凋亡。

p21WAF/CIPI是最早被发现的细胞周期素依赖激酶抑制因子（CDKI），CDKI通过与细胞周期素——CDK复合物紧密结合，或与CDK直接结合，抑制细胞周期素与CDK结合而实现负调控作用。p21WAF/CIPI还可通过抑制CDK2/cyclin B激酶复合物的活性引起G2/M期阻滞。是细胞周期调控中最具重要意义的负调控因子［6］。Varshochi［7］和 Davie［8］通过各自实验认为SP1/SP3是p21转录启动子的结合点，HDAC浓聚可使p21的转录抑制。HDACI则可抑制SP1/SP3与HDAC结合或使其从SP1/SP3上分离，提高组蛋白乙酰化水平，使p21转录活性增强，p21蛋白重新表达。

已有实验表明，在卵巢癌中p21WAF/CIPI基因转录、蛋白表达减少，是卵巢癌发生、发展的因素之一。而TSA可以诱导p21WAF/CIPI在多种肿瘤细胞中表达增强［9，10］，推测组蛋白乙酰化修饰是 p21WAF/CIPI在肿瘤细胞中表达静默的基础。本实验将不同浓度或不同时间的曲古抑菌素作用于A2780细胞，发现曲古抑菌素可以时间和剂量依赖的形式增强p21WAF/CIPI的表达，而p21WAF/CIPI表达的变化与肿瘤细胞周期分布的变化趋势相一致。推测TSA可通过使p21WAF/CIPI基因组蛋白明显乙酰化，增加转录活性，增加p21WAF/CIPI的表达，进而引起G2/M期阻滞，抑制细胞过度增殖，对细胞增长停滞起关键作用。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过对其靶基因p21WAF/CIPI的调节，干扰细胞周期，阻碍细胞分裂，实现对卵巢癌细胞增殖的抑制作用，有望成为临床上治疗恶性肿瘤的有效手段。

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