姜黄素对喉癌Hep-2细胞增殖及Bcl-2、Bax基因表达的影响

张 立,刘剑凯,孙吉凤,邹 维

(1.长春医学高等专科学校 生物化学教研室,吉林 长春 130031;2.吉林大学白求恩医学院生物化学与分子生物学教研室,吉林长春 130021)

姜黄素对喉癌Hep-2细胞增殖及Bcl-2、Bax基因表达的影响

张 立1,刘剑凯2,孙吉凤1,邹 维1

(1.长春医学高等专科学校 生物化学教研室,吉林 长春 130031;2.吉林大学白求恩医学院生物化学与分子生物学教研室,吉林长春 130021)

目的探索姜黄素对喉癌细胞增殖的作用以及对细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响。方法Hep-2细胞暴露于含姜黄素(3-25μ M)的培养基中,分别培养24h及48h,用MTT法检测对细胞增殖的影响;用RT-PCR法检测Bcl-2和Bax的mR NA表达水平。结果MTT显示,姜黄素使Hep-2细胞增殖明显降低,并呈时间-剂量依赖性;RT-PCR结果显示,姜黄素使Bcl-2的mRNA表达水平降低,而使Bax的mRNA表达水平升高,并呈剂量和时间依赖性。结论姜黄素对人喉癌Hep-2细胞增殖具有显著的抑制作用。其作用机制可能与其下调Bcl-2基因表达水平及上调Bax基因表达水平,从而诱导细胞凋亡有关。

姜黄素;喉癌细胞;细胞增殖;Bcl-2;Bax

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1053)

本实验研究姜黄素对喉癌细胞株Hep-2增殖的影响,及其对Hep-2细胞 Bcl-2、Bax基因表达的影响。

1 材料及方法

1.1 细胞与试剂

人喉癌Hep-2细胞购于上海细胞生物研究所。RPMI1640培养基购于Gibco/BRL公司。姜黄素(Curcumin)购自美国SIGMA公司,用DMSO溶解后配成50 mM的贮存液置-20℃冰箱保存,实验时稀释至所需浓度。四甲基偶氮唑盐(MTT)为北京鼎国生物技术公司产品。RT-PCR kit购自宝生物公司;Bcl-2及Bax基因引物由宝生物公司合成;PCR扩增仪为Minicvcler M7 Research公司产品。

1.2 细胞培养

喉癌细胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS(北京鼎国生物技术公司产品,经56℃30 min灭活),100 U/ml青霉素及 100 μ g/ml链霉素的 RPMI1640培养液中,单层细胞培养;37℃5%CO2孵箱中培养传代,每次传代均以0.25%胰蛋白酶消化,洗涤一次,更换新培养基。传代浓度为5×105个/ml。

1.3 MTT法检测Hep-2细胞增殖

取对数期生长的Hep-2细胞按每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中,5%FBS的RPMI1640培养液培养24 h后,更换成无血清的RPMI1640培养液同步化培养 24 h,最后再更换成5%FBS的 RPMI1640 培养液,并加入姜黄素(3、6、12.5、25 μ M),每组药物浓度设5个复孔,同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂DMSO)和不接种细胞的空白对照。在CO2孵箱中分别培养24 h及48 h后,每孔加入20 μ l MTT,继续孵育 4 h 后,弃上清液 ,加入 150 μ l DMSO,轻轻振荡10分钟,使蓝紫色结晶物完全溶解,于570 nm波长处在酶标仪上测光吸收值(OD值),求平均值,计算药物对细胞生长增殖的抑制率。抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 RT-PCR检测Bcl-2和Bax基因mRNA表达

取对数期生长的Hep-2细胞按每孔5×105个细胞接种于培养瓶中,5%FBS的RPMI1640培养液培养24 h后,更换成无血清的RPMI1640培养液同步化培养24h,最后再更换成5%FBS的RPMI1640培养液,并分别加入浓度为 12.5及25 μ M 的姜黄素,同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂DMSO);每组设5个平行样。继续培养至24 h或48 h,用Trizol Reagent分别提取细胞总RNA,经紫外分光光度仪检测A260 nm/A280 nm＞1.8,并经 l%琼脂糖凝胶电泳,其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍,这表明RNA样品比较完整,基本无降解。定量后逆转录,逆转录产物进行聚合酶链反应(PCR)。以GAPDH为内参照。根据GenBank中Bcl-2,Bax,GAPDH的cDNA序列,利用引物设计软件Primer5.0设计Bcl-2,Bax,GAPDH的引物,并由宝泰克生物技术公司合成。

引物序列如下:Bcl-2 sense:5′-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3′,antisense:5′-AGGCACCCAGGGTGATGC AA-3′,PCR 产物304 bp;Bax sense:5′-TCCACCAAGAA GCTGAGCGAG-3′,antisense:5′-GTCCAGCCCATGATGG TTCT-3′,PCR 产物 257 bp;GAPDH sense:5′-GCTATAGGTGAGGTCGAGAGTC-3′antisense:5′-GAGACGATGGCTGATGATCTCTC-3′PCR产物260 bp。

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析,对照分子量标准检测扩增结果。凝胶紫外摄像系统中照相并运用Kodak凝胶电泳呈像分析系统(EDAS)分析不同条带的灰度值A,检测各组PCR产物与其对应的内参GAPDH mRNA的 PCR产物A值,然后将ABcl-2/AGAPDH、Abax/AGAPDH的比值进行统计分析。每个实验重复3次。

1.5 数据的处理

用SPSS统计软件对结果进行分析,实验数据取均数±标准差表示,采用方差分析和t检验。

2 实验结果

2.1 姜黄素对Hep-2细胞增殖的影响

图1 为终浓度分别为 3、6 、12、25 μ M 的姜黄素作用24 h、48h后,对各组细胞生长的影响。其中24 h作用组中,各浓度的抑制率分别为10.18%、35.38%、50.45%、82.13%,组间存在显著差异(P ＜0.05);其中48 h作用组中,各浓度的抑制率分别为29.05%、59.13%、81.25%、94.43%,组间存在显著差异(P＜0.05);说明不同浓度的姜黄素作用于肿瘤细胞,在一定浓度范围内(3-25 μ M),随剂量增加,姜黄素对Hep-2细胞增殖的抑制率增加,呈剂量依赖性。同时48 h作用组与24 h作用组不同浓度下的抑制率之间有明显差别(P＜0.05),说明随着时间的延长,姜黄素的抑制增殖效应逐渐增强,呈时间依赖性。

图1 姜黄素对Hep-2细胞增殖的影响

2.2 姜黄素对Hep-2细胞Bcl-2、Bax表达的影响

通过RT-PCR法检测Hep-2细胞Bcl-2及Bax的mRNA含量,研究姜黄素是否对Hep-2细胞Bcl-2及Bax的mRNA表达存在影响。Hep-2细胞经姜黄素作用后,以Trizol法提取总RNA,经RT-PCR后,所得产物进行2%琼脂糖电泳,Bcl-2基因扩增产物长度为304 bp,Bax基因扩增产物长度为257 bp,GAPDH基因扩增产物长度为260bp(图-2)。

表1 姜黄素作用后,Hep-2细胞Bcl-2 mRNA(A),Bax mRNA(B)表达的定量分析(±s,n=3)

表1 姜黄素作用后,Hep-2细胞Bcl-2 mRNA(A),Bax mRNA(B)表达的定量分析(±s,n=3)

注:*P＜0.05与溶剂对照组比较,△P＜0.05与24 h作用组比较,▲P＜0.05与Curcumin 12.5 μ M作用组比较

组别 Bcl-2 Bax 24 h溶剂对照组 0.415 7±0.027 0 0.593 6±0.015 7 24 h Curcumin 12.5 μ M 0.387 5±0.034 2* 0.659 7 ±0.030 8*24 h Curcumin 25 μ M 0.278 2±0.002 9*▲ 0.746 3±0.050 2*▲48 h溶剂对照组 0.579 3±0.023 5 0.608 4±0.036 2 48 h Curcumin 12.5 μ M 0.287 8±0.014 7*△ 0.865 8±0.043 2*△48 h Curcumin 25 μ M 0.159 1±0.014 0*△▲ 0.951 7±0.012 6*△▲

应用Kodak凝胶电泳呈像分析系统(EDAS)分析不同条带的灰度值可见(表1),同未经药物处理的溶剂对照组相比,无论是24 h作用组还是48 h作用组,姜黄素作用的细胞中Bax和Bcl-2转录产物的丰度有明显改变,前者随姜黄素浓度的增加而增加,后者则相反,均呈剂量相关性。此外,与24 h作用组相比,48 h作用组Bcl-2表达减弱,而Bax表达增强。表明姜黄素在转录水平对Bcl-2表达的下调作用和对Bax表达上调作用同时呈剂量和时间依赖性(P＜0.05)。

图2 姜黄素作用后Hep-2细胞Bcl-2 mRNA(A),Bax mRNA(B)表达的电泳图

3 讨论

姜黄素作为中药姜黄的主要活性成分之一,具有不良反应小,药理作用广泛等特点,近年在抗肿瘤方面的作用倍受关注。本实验针对姜黄素对人喉癌Hep-2细胞增殖和Bcl-2,Bax的mRNA表达的作用展开研究,运用不同浓度的姜黄素处理Hep-2细胞,在不同时间观察姜黄素的作用结果。

MTT分析方法是基于活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶对MTT的水解作用产生蓝紫色结晶物的原理来评价细胞增殖和细胞介导的细胞毒性作用的方法。通过MTT法发现,姜黄素在3-25 μ M 浓度范围内,对人喉癌Hep-2细胞增殖有明显的时间-剂量依赖性抑制作用(P＜0.05)。

有文献表明[1,2],姜黄素的抗肿瘤可能涉及的机制主要包括:诱发肿瘤细胞凋亡、阻断肿瘤细胞的生长信号传导通路、抗氧化和抑制肿瘤血管生成等方面。其中通过诱发肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤的作用是近年来研究的热点,已有大量研究表明[3,4],肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致,促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是导致肿瘤细胞凋亡被抑制而长期存活的主要原因。

肿瘤细胞凋亡是一个多基因参与调控的复杂过程,其中Bcl-2家族是其中最重要的基因之一,其编码的蛋白能抑制细胞凋亡。它们中如Bcl-2、Bcl-xL抑制细胞凋亡,Bax、Bak则促进细胞凋亡,这些调节基因表达的改变不仅影响正常细胞的凋亡,还影响肿瘤细胞的凋亡。如Bcl-2可导致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集,从而促进肿瘤的发生发展[5]。

进一步的 RT-PCR研究表明,终浓度为 12.5 μ M、25 μ M 的姜黄素可使人喉癌Hep-2细胞Bcl-2的mRNA表达量降低,具有抑制其表达作用;而使Bax的mRNA表达量增加,具有促进其表达作用。提示姜黄素可能通过上调Bax的基因表达,下调Bc1-2基因表达诱导喉癌Hep-2细胞凋亡。但其确切机制尚待进一步研究。

综上所述,姜黄素对喉癌Hep-2细胞的增殖抑制作用,对Bcl-2 mRNA表达的下调作用,对Bax mRNA表达的上调作用机制的阐明为喉癌治疗开辟了新的方向,为开发有效的喉癌治疗药物提出了广阔的前景,同时也拓展了姜黄素抗癌机制的研究。此外,对姜黄素抗喉癌的分子机制还可在更多的方面展开,如原癌基因c-fos、c-jun、c-myc及P53等在姜黄素作用下的表达情况研究,及近年研究比较热的真核转录因子NF-FB、AP-1等的研究[6,7]。

[1]黄珈雯.姜黄素的抗肿瘤作用研究进展[J].甘肃中医,2008,21(1):55.

[2]刘晓真,张宏颖.姜黄素与肿瘤细胞作用的分子机制[J].大连医科大学学报,2008,30(5):465.

[3]Suzuki O,Abe M.Cell surface N-glycosylation and sialylation rulate galectin-3-induced apoptosisin human diffuse large B cell lymphoma[J].Oncol Rep,2008,19(3):743.

[4]Takai N,Ueda T,Nishida M,et al.Histone deacetylase inhibitors induce growth inhibition,cell cycle arrest and apoptosis in human choriocarcinoma cells[J].Int J Mol Med,2008,21(1):109.

[5]Cory S,Huang DC,Adams JM.The Bcl-2 family:roles in cell survival and oncogenesis[J].Oncogene,2003,22(53):8590.

[6]Azhar R.Hussain,Maqbool Ahmed,Naif A.Al-Jomah,et al.Curcumin suppresses constitutive activation of nuclear factor-B and requires functional Bax to induce apoptosis in Burkitt's lymphoma cell lines[J].Mol.Cancer Ther,2008,7:3318.

[7]Christian Freudlsperger,Johannes Greten,Udo Schumacher.Curcumin Induces Apoptosis in Human Neuroblastoma Cells via Inhibition of NF B[J].Anticancer Res,2008,28:209.

Effect on the expression of Bcl-2,Bax and on cell proliferation by curcumin in laryngeal cancer cell Hep-2

ZHANGLi,LIU Jian-kai,SUN Ji-feng,et al.(Department of Biochemistry,Basic Medical School,Changchun Medicial College,Changchun130031,China)

ObjectiveTo study effect of curcuminon proliferation and the expression of Bcl-2,Bax in laryngeal cancer cell Hep-2.MethodsHep-2 cells were exposed to curcumin at concentrations from 3 to 25 μ M,cultured for 24 h or 48 h.MTT was used to determine cell proliferation.The expression levels of Bcl-2,Bax mRNA were analyzed by RT-PCR.ResultsMTT showed that the cell proliferationwas down regulated by curcumin significantly in a does and time dependent manner;RT-PCR showed that the expression of Bcl-2 was decreased and the Bax mRNA was increased by curcumin.ConclusionCurcumin inhibits the proliferation of laryngeal cancer Hep-2 cells significantly.The possible mechanism is related with curcumin down regulating bcl-2 but up regulating bax.

curcumin;laryngeal cancer cell;cell proliferation;Bcl-2;Bax

R739.65

A

1007-4287(2010)07-1053-03

吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目资助课题(2008-432)

张立(1958-),女,教授,主要从事生化药物研究。

2008-11-15)