调节性T细胞和Th17细胞在自身免疫性疾病中的研究进展

周运恒,马红霞,熊怡凇,仲人前

(1.武警上海总队医院检验科,上海 201103;2.上海市东方医院;3.第二军医大学附属长征医院实验诊断科)

调节性T细胞和Th17细胞在自身免疫性疾病中的研究进展

周运恒1,马红霞2,熊怡凇3,仲人前3

(1.武警上海总队医院检验科,上海 201103;2.上海市东方医院;3.第二军医大学附属长征医院实验诊断科)

*通讯作者

机体的免疫系统维持着对感染性抗原的反应和自身耐受的平衡,在多数情况下机体能够在免疫调控机制的精密控制下,通过适度的免疫应答防止病原微生物的入侵、监视并清除机体内恶变的细胞同时保持内环境的稳定。但是,一旦这样的调控机制出现异常,将会导致免疫病理反应从而对机体造成伤害,如自身免疫性疾病等。免疫系统的自身稳定是通过中枢耐受和外周耐受实现的,而对自身抗原产生免疫耐受则是防止发生自身免疫病的关键。近年来随着研究的深入,CD4+CD25+Treg细胞(T regulatory cell,Treg)作为一种专职的调节性T细胞亚群,是近年来免疫学领域有关免疫负相调控最大的研究热点,其能够阻止自身反应性T细胞的活化,并抑制自身免疫性疾病的发生,在维持自身耐受中的作用得到进一步的认识[1]。本文主要对Treg细胞和Th17细胞的研究过程、分类、特征、与自身免疫性疾病之间的关系和存在问题等方面进行综述。

1 Treg细胞

1.1 研究过程 初在20世纪70年代Gershon和Kondo提出的抑制性T细胞,但缺乏特征性标记,所以这方面的研究进展缓慢[2]。Sakaguchi[3]于1995年发现一种新的CD4 T+细胞可以表达IL-2受体的α链(CD25),这群细胞在啮齿类动物的体内和体外都可以抑制免疫反应,从此CD4+CD25+T细胞被命名为Treg,由其介导的“主动免疫调节”机制引起了免疫学家的极大兴趣。打破以往对免疫耐受机制的认识,受到关注。

1.2 分类及特征 根据起源、特异性和发挥效应的机制的不同,目前调节性T细胞可分为:天然调节性T细胞(natural Treg,nTreg或专职Treg),在预防病理性自身免疫反应方面发挥作用;获得性调节 T细胞(inducible Treg,iTreg),包括Tr1、Th3、人工诱导的CD4+CD25+T细胞等,另外尚有 CD8+Treg细胞等,在微生物感染和移植免疫中起作用(见表1)。最近曹雪涛等发现的新型Treg细胞不表达CD25和Foxp3而高表达CD69,CD25和CD69是CD4+T细胞的活化性标志,在炎症反应过程中大量活化的CD4+T细胞一过性表达CD25和CD69;然而在研究肿瘤免疫调控机制过程中发现伴随肿瘤进展,CD69在CD4+T细胞上的表达呈进行性升高,而CD25大多为阴性,进一步通过体外和体内实验证明CD4+CD69+CD25-T细胞能够显著抑制CD4+T细胞的增殖,具有负相免疫调控作用[4]。

1.3 分泌的细胞因子和表面标记 CD4+CD25+Treg细胞是一群增殖能力低、具有免疫抑制功能的细胞,它可被多克隆激活剂和自身抗原激活,活化后的细胞表面分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4,CTLA-4)表达增加,主要分泌 IL-l0和TGF-β,并表达转录因子叉头样转录因子(foxhead box protein 3,Foxp3)。Foxp3+Treg细胞的2个重要特征是其持续表达CTLA-4,而其他T细胞只有在激活后才能表达CTLA-4,另外Foxp3可以控制Treg中CTLA-4的表达。

1.4 与自身免疫性疾病的关系 对CD4+CD25+Treg细胞在自身免疫性疾病中的深入研究将有助于了解机体免疫调节的机制和认识自身免疫性疾病的病理、生理机制,从而使Treg用于治疗自身免疫性疾病尽早变成现实。

鉴于Treg对维持机体免疫耐受的关键作用,推测其数量和(或)功能的异常必定和疾病的发生发展密切相关。在小鼠体内基因敲除或阻断nTreg细胞的功能,可以导致多种自身免疫性疾病的发生,如甲状腺炎,睾丸炎,卵巢炎,I型糖尿病和炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),而注入CD4+CD25+T细胞后,可以阻止这些疾病的发生,说明nTreg细胞可以调节多种器官特异性自身免疫性疾病的发生[5]。

表1 调节性T细胞的主要分类及特点

在人类自身免疫病方面,许多学者发现CD4+CD25+T细胞能够抑制自身抗原引起的不利反应,其数量或功能缺陷与疾病的发生发展有一定关系。在多发性硬化患者,研究发现外周血CD4+CD25+T细胞抑制T细胞增生和产生IFN-γ的能力降低。而在I型糖尿病、银屑病和重症肌无力患者也有类似的报道,与健康对照组相比较,这些患者外周血CD4+CD25+T细胞的百分比并没有明显改变,说明是CD4+CD25+Treg的功能而不是数量缺陷导致疾病的发生[6]。

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是多器官损伤的炎症性自身免疫疾病,其发病机制十分复杂。研究表明SLE患者体内存在中枢和外周免疫耐受破坏,体内自身反应性T细胞直接与疾病的发生和发展密切相关。疾病活动期SLE患者外周血CD4+CD25+Treg细胞显著低于稳定期患者和正常人,这将有助于通过检测 SLE患者外周血CD4+CD25+Treg细胞来了解患者的疾病活动性[7]。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征、免疫紊乱为主的慢性全身性自身免疫性疾病。Cao等[8]对27例RA患者外周血和关节液中的CD4+CD25+T细胞进行了检测,发现 RA患者外周血中CD4+CD25+T细胞数量与正常对照组差异无显著性,但关节液中CD4+CD25+T细胞的数量却明显高于对照组。Van Amelsfort等[9]也证实了R A活动期滑膜液的CD4+CD25+T细胞数量显著高于外周血。进一步研究发现,关节液中的CD4+CD25+T细胞能抑制外周血及关节液中的CD4+CD25+T细胞增生,说明它们是一类具有免疫抑制功能的调节性T细胞亚群。

Longhi等[10]对自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)患者外周血CD4+CD25+Tregs数量及功能进行了系统研究,发现AIH患者外周血CD4+CD25+Tregs数量缺失且功能受损;CD4+CD25+Tregs Foxp3的表达比健康对照低;CD4+CD25+Tregs与靶细胞直接接触引起调节性细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β分泌增加,而患者中 TGF-β的分泌却明显低于健康对照。

Lan等[11]发现,原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者外周血CD4+CD25+Tregs数量低于健康对照,外周血单核细胞和肝脏浸润淋巴细胞CD4+CD25+Tregs比例低于丙型肝炎患者,肝脏浸润淋巴细胞中含有更多的PDC特异性B细胞,说明肝脏中CD4+CD25+Tregs数量减少可能诱导自身反应性B细胞产生抗线粒体抗体(antimitochondrial antibodies,AMA)。Sasaki等[12]发现PBC患者胆管炎症区CD4+CD25+Tregs数量增加,增加程度与炎症损害程度相关,说明PBC患者外周血和肝内Tregs数量在反映肝损伤程度上的变化是一致的,推测机体可能通过免疫调节使具有抑制作用的CD4+CD25+Tregs代偿性增殖来增强对效应T细胞的抑制作用。

1.5 存在问题 在很多自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)动物模型,输入体外扩增的CD4+CD25+Treg或体内用药物和细胞因子提升该细胞免疫功能可缓解疾病症状或使病痊愈。然而,临床实践中如何维持Treg细胞在体内的抑制活性;如何在体内或体外活化扩增产生足够的Treg以达到治疗目的;什么样的刺激能更好地提升Treg功能,Treg治疗AID有效性多大,怎样才能发挥最佳治疗效应?随着这些问题研究的深入,相信在应用Treg细胞治疗AID上会找到新的突破口,将来CD4+CD25+Treg细胞会成为征服AID新颖有效的“魔力子弹”。

2 Th17细胞

2.1 研究过程 CD4+T细胞按照分化和功能特征分为Th1、Th2和调节性T细胞(Treg)。研究者在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)和胶原蛋白诱导性关节炎(colagen induced arthritis,CIA)这些自身免疫病模型中,发现了一种IL-23相关的且能够分泌IL-17的新的Th细胞亚群,EAE和CIA属于两种典型的自身免疫性疾病模型,将来自EAE小鼠富含产生IL-17的CD4 T细胞转输给正常小鼠后,可诱导出严重的 EAE,但输入Thl细胞却不能诱导出EAE[13-14]。2005年Harrington等[15]依据分泌细胞因子的不同,首次提出了“Th17细胞”的概念。Thl7细胞不同于Th1和Th2细胞,其介导炎性反应,在自身免疫性疾病等的发生、发展和转归过程中发挥重要的作用。Th17细胞一经发现就引起了研究者们的浓厚兴趣。这一T细胞亚群的发现,完善了T细胞分化的途径,丰富了以往的 Th1、Th2、Th3、Treg的 T细胞亚群的种类,增进了人们对T淋巴细胞以及特异性免疫应答的进一步了解[16]。

2.2 分泌的细胞因子和分化的调控因素 Th17形成后上调IL-23R,并且分泌 IL-17、IL-17F、IL-21以及 IL-22[17]。在人类Th17细胞的分化过程中,有多种细胞因子参与其诱导和分化的调控,如 IL-1、IL-6、IL-17、IL-23和 TGF-β等[18]。IL-23可以通过上调促炎症因子TNF-α、IL-1β和 IL-17的分泌间接促进炎症的发生。虽然IL-23不是Th17细胞分化的诱导因子,但在分化起始后Thl7细胞存活、功能维持以及之后介导的免疫应答中发挥不可或缺的作用[19]。Acosta-Rodriguez EV[20]研究发现在体外实验中,TGF-β和IL-6可以取代活化DC培养液,诱导Thl7细胞的分化;其他细胞因子如IL-1和TNF-α能够促进TGF-β和IL-6诱导 Thl7细胞的分化,但不能取代TGF-β和IL-6[21],有报道称在体内实验中,TGF-β可能对Th17的分化不起作用[22],而且还有研究表明TGF-β是Th17细胞分化的抑制因子但TGF-β对Th17细胞的分化目前还存在争议。Thl7细胞亚群的分化和功能均受Thl和Th2细胞因子的调控。而 IL-4、IFN-γ、IL-27、IL-25以及 SOCS3(suppressor of cytokine signaling3)蛋白则能抑制其分化。

2.3 与自身免疫性疾病之间的关系 类风湿性关节炎Th17细胞在R A中起重要的作用,患者血清及关节液中的IL-17、IL-6、IL-1β和TNF-α升高,肿胀的关节滑液Th17细胞及中性粒细胞聚集。早期研究认为,IL-1β和TNF-α诱导RA患者滑膜中IL-6和IL-8的产生,IL-17起协同促进作用。然而,最近的研究表明,IL-17本身即能够刺激炎症反应的发生,RA患者关节滑液中IL-17的含量明显高于骨性关节炎患者滑液中的IL-l7含量[23]。因此,Th17细胞很可能在自身免疫反应的发生和发展中起关键的作用。

炎症性肠病IL-21是Th17自分泌的一种重要的细胞因子,在动物实验中,其被发现可以通过上调Thl7和下调Treg明显加重局部炎症,Crohn's病及溃疡性结肠炎患者血清IL-17明显增高,在活动期更甚,Crohn's病人外周血和和肠组织炎症部位的Th17细胞的数量显著增高,证明了 Th17与Crohn's病的发病密切相关[24]。二者的炎性肠粘膜中IL-17表达于T细胞和部分单核-巨噬细胞,活动期的Crohn's病患者炎性肠粘膜IL-17+T细胞是健康人的20倍,是非活动期的4倍。在治疗方面,IL-6及TNF-α受体拮抗剂以及IL-12P40中和抗体显示了明显的疗效,这足以表明Th17即使不是引起IBD最主要因素也必定参与疾病的发生和发展[25]。

多发性硬化症MS患者的树突状细胞较正常人可以分泌更多的IL-23,而IL-12水平相当,其外周血及脑脊液单个核细胞表达更多的IL-17mRNA,且活动期IL-17mRNA表达是缓解期的3.5倍[26]。上述研究结果表明和其他许多自身免疫性疾病一样,Th17可能是引起MS发病的主要原因之一。

系统性红斑狼疮Th17细胞通过分泌IL-17和IL-21,促进自身反应性B细胞的扩增,增加自身抗体的产生。在狼疮小鼠模型中已证实,Th17细胞及其分泌的IL-17与狼疮的发生密切相关[27]。

原发性胆汁性肝硬化 最近Lan RY[28]研究发现在PBC病人的肝组织有大量的IL-17阳性的淋巴细胞浸润,PBC动物模型的肝脏中IL-17的表达也显著性升高,从而推断Th17在PBC发病过程中的重要作用。我们课题组也发现在PBC外周血中Th17数量、R ORγ t以及促其分化的细胞因子水平均升高,而Treg细胞数量和Foxp3的表达下降,这种Th17/Treg表达的平衡紊乱可能与PBC的发病相关[29]。

2.4 存在问题 目前还有众多关键性问题尚待解答:Th17细胞同其他Th细胞(包括Treg)之间的关系,他们是来源于共同的前体吗?如何将调节性T细胞和活化的T细胞区分开?他们之间是相对稳定的还是可以在一定条件下相互转化?Th17细胞和其它细胞之间表观遗传学的差异是如何形成的以及如何调控?病原体及其产物如何不同地调节Th1、Th17以及Treg形成,Th17细胞应答诱导自身免疫性疾病的发病机理关键所在?

3 Treg细胞与Th17细胞之间的关系

目前研究者们更感兴趣的是Th17细胞和Treg细胞之间的联系。研究者认为,Th17细胞和Treg细胞在功能上互相拮抗,Th17似乎是AID的启动细胞,而Treg细胞只能减轻Th17所诱发的自身免疫病症状,两者相互拮抗的结果是维持机体免疫状态相对稳定,但在分化过程中二者则具有相关性,这主要依赖于机体固有免疫系统的状态以及IL-6的产量。当机体处在稳定状态下或者没有炎症损伤的情况下,免疫系统产生的TGF-β抑制效应T细胞的增殖,诱导Foxp3+Treg细胞,从而维持机体的免疫耐受。但当存在感染或炎症时,Toll样受体激活的免疫系统产生大量的IL-6,就会抑制TGF-β诱导的Treg细胞的增殖,并诱导主要由Thl7细胞参与的致炎的T淋巴细胞反应,从而介导了前炎症反应。

也有学者认为TGF-β的浓度与Treg和Th17的分化有关,如低浓度的TGF-β与IL-6协同作用可促进Th17分化,而高浓度的TGF-β促进Foxp3表达,通过与ROR γ t的直接结合,抑制Th17形成,但这种抑制作用可以被IL-6、IL-21和IL-23所阻断[30]。维甲酸也可以通过上调Foxp3表达,使分化偏向Treg方向。另外一种配体依赖的转录因子芳香烃受体也调控着Treg和Th17之间的平衡。进一步研究表明,无论是iTreg还是nTreg,在IL-6、IL-1β和IL-2等细胞因子作用下都可以重分化为 Th17细胞,并且表达 ROR γ t,此过程中 Foxp3的下调依赖于 STAT3,而 IL-17 的 表 达 则依赖于 ROR γ t、ROR α和STAT3[31]。

在体内阻断这些关键的细胞因子,如 IL-6,可能会使Th17细胞向Treg细胞转化,抑制自身免疫性疾病的发生以及阻止移植物的排斥。另外,值得注意的是,注射Treg细胞到含有高水平致炎症因子的环境(比如AID患者和接受器官移植的患者等),如果它们在体内转化成为“致病性”Th17细胞,这将会对利用Treg细胞进行治疗带来影响。因此有关Treg细胞与Thl7细胞之间的相互关系和细胞因子在其中的作用机制,以及它们在免疫排斥/耐受中的作用还需要进一步的研究。

[1]Sakaguchi S,Yamaguchi T,Nomura T,et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell,2008,133(5):775.

[2]Gershon RK,Kondo K.Cell interactions in the induction of tolerance:the role of thymic lymphocytes[J].Immunol,1970,18:723.

[3]S.Sakaguchi,N.Sakaguchi,M.Asano,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains[CD25].Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol 1995,155:1151.

[4]Han Y,Guo Q,Zhang M,et al.CD69+CD4+CD25-T cells,a new subset of regulatory T cells,suppress T cell proliferation throughmembrane bound TGF-β1[J].J Immunol,2009,182(1):111.

[5]Levings MK,Allan S,d'Hennezel E,et al.Functional dynamics of naturally occurring regulatory T cells in health and autoimmunity[J].Adv Immunol,2006,92:119.

[6]Chentoufi AA,Binder NR,Berka N,et al.Advances in type I diabetes associated tolerance mechanisms[J].Scand J Immunol,2008,68(1):1.

[7]Costantino CM.Baecher Allan CM,Hailer DA.Human regulatory T cells and autoimmunity[J].Eur J Immunol,2008,38(4):921.

[8]Cao D,Malmstrom V,BaecherAllan C,et al.Isolation and functional characterization of regu latory CD25 CD4 T cells from the target organ of patients with rheumatoid arthritis[J].Eur J Immunol,2003,33:215.

[9]Van Amelsfort JM,Jacobs KM,Bijlsma JW,et al.CD4 CD25 regulatory T cells in rheumatoid arthritis:differenees in the presence,phenotype,and function between peripher blood and synovial fluid[J].Arthritis Rheum,2004,50(9):2775.

[10]Longhi MS,HussainMJ,Mitry RR,et al.Functional study of CD4 CD25 regulatory T cells in health and autoimmune hepatitis[J].J Immunol,2006,176(7):4484.

[11]Lan RY,Cheng C,Lian ZX,et al.Liver targeted and peripheral blood alterations of regulatory T cells in primary biliary cirrhosis[J].Hepatology,2006,43(4):729.

[12]Sasaki M,Ikeda H,Sawada S,et al.Naturally-occurring regulatory T cells are increased in inflamed portal tracts with cholangiopathy in primary biliary cirrhosis[J].J Clin Pathol,2007,60(10):1102.

[13]Aggarwal S,Ghilardi N,Xie MH,et al.Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the productionof interleukin-17[J].J Biol Chem,2003,278(3):1910.

[14]Weaver CT,Murphy KM.The central role of the Th17 lineage in regulating the inflammatory/autoimmune axis[J].Semin Immunol,2007,19(6):351.

[15]Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immunol,2005,6(11):1123.

[16]Chen Z,Laurence A,O'Shea JJ.Signal transduction pathways and transcriptional regulation in the control of Th17 differentiation[J].Semin Immunol,2007,19(6):400.

[17]Izcue A,Hue S,Buonocore S,et al.Interleukin-23 restrains regulatory T cell activity to drive T cell-dependent colitis[J].Immunity,2008,28(4):559.

[18]Volpe E,Servant N,Zollinger R,et al.critical function for transforming growth factor-beta,interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human T(H)-17 responses[J].Nat Immunol,2008,9(6):650.

[19]Izcue A,Hue S,Buonocore S,et al.Interleukin-23 restrains regulatory T cell activity to drive T cell-dependent colitis[J].Immunity,2008,28:559.

[20]Acosta-Rodriguez EV,Napolitani G,Lanzavecchia A,et al.Interleukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells[J].Nat Immunol,2007,8(9):942.

[21]Wilson NJ,Boniface K,Chan JR,et al.Development,cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells[J].Nat Immunol,2007,8(9):950.

[22]Chen Z,O'Shea JJ.Th17 cells:a new fate for differentiating helper T cells[J].Immunol Res,2008,41(2):87.

[23]Parsonage G,Filer A,Bik M,et al.Prolonged granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent,neutrophil survival following rheumatoid synovial fibroblast activation by IL-17 and TNFalpha[J].Arthritis Res Ther,2008,10(2):R47.

[24]Annunziato F,Cosmi L,Santarlasci V,et al.Phenotypic and functional features of human Th17 cells[J].J Exp Med.2007;204(8):1849.

[25]Fina D,Sarra M,Fantini MC,et al.Regulation of gut inflammation and th17 cell response by interleukin-21.Gastroenterology[J].2008,134(4):1038.

[26]Vaknin-Dembinsky A,Balashov K,Weiner HL.IL-23 is increased in dendritic cells in multiple sclerosis and down-regulation of IL-23 by antisense oligos increases dendritic cell IL-10 production[J].J Immunol,2006,176(12):7768.

[27]Garrett-Sinha LA,John S,Gaffen SL.IL-17 and the Th17 lineage in systemic lupus erythematosus[J].Curr Opin Rheumatol,2008,20(5):519.

[28]Lan RY,Salunga TL,Tsuneyama K,et al.Hepatic IL-17 responses in human and murine primary biliary cirrhosis[J].J Autoimmun,2009,32(1):43.

[29]Rong GH,Zhou YH,Xiong YS,et al.Imbalance between T helper type 17 and T regulatory cells in patients with primary biliary cirrhosis:the serum cytokine profile and peripheral cell population[J].Clin Exp Immunol,2009,156(2):217.

[30]Zhou L,Lopes JE,Chong MM,et al.TGF-beta-induced Foxp3 inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function[J].Nature,2008,453(7192):236.

[31]Deknuydt F,Bioley G,Valmori D,et al.IL-1beta and IL-2 convert human Treg into T(H)17 cells[J].Clin Immunol,2009,131(2):298.

1007-4287(2010)07-1152-04

国家863项目(2006AA02Z496)

周运恒(1976-),男,博士,主要从事自身免疫性疾病的研究。

2010-03-26)