TNF参与内毒素诱导肥大细胞HMGB1释放

杨 岚,李 蕾,许 飞,帅朝霞,陈国千*

(1.南京医科大学附属无锡妇幼保健院检验科,江苏无锡 214002;2.南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科;3.皖南医学院第二附属医院检验科)

TNF参与内毒素诱导肥大细胞HMGB1释放

杨 岚1,李 蕾2,许 飞1,帅朝霞3,陈国千2*

(1.南京医科大学附属无锡妇幼保健院检验科,江苏无锡 214002;2.南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科;3.皖南医学院第二附属医院检验科)

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在内毒素诱导肥大细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放中的作用。方法采用小鼠肥大细胞株P815培养物,观察100 μ g/L脂多糖(LPS)诱导后培养上清液中HMGB1、TNF-α含量的变化,不同剂量抗TNF-α中和抗体IgG对 LPS诱导HMGB1释放的影响,及TNF-α对HMGB1释放的诱导作用。HMGB1含量采用酶联免疫吸附试验检测。结果培养上清液中HMGB1含量随LPS诱导时间而升高,而TNF-α含量于诱导6 h时达到峰值;5、25 mg/L抗TNF-α抗体对LPS诱导HMGB1释放有明显的抑制作用(P＜0.05);TNF-α显示具有诱导肥大细胞释放HMGB1的作用,并呈时间、剂量相关性。结论TNF-α参与内毒素诱导肥大细胞释放HMGB1的过程。

高迁移率族蛋白B1;肥大细胞;内毒素;肿瘤坏死因子-α

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0985)

肥大细胞为体内的一种重要免疫细胞。近年研究[1-4]显示,肥大细胞在内毒素作用下,释放肿瘤坏死因子(TNF)、白介素、组胺等多种细胞因子或生物活性介质,参与急慢性炎症反应。胞外高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)作为近年发现的一种重要晚期炎症介质,受到广泛关注和重视[5];多种组织细胞如巨噬细胞、上皮细胞、肝细胞等受内毒素等激活后释放HMGB1,参与诸多疾病如脓毒症、关节炎、急性胰腺炎、肺炎等的发病过程[6-9]。我们最近研究发现,内毒素能诱导肥大细胞释放HMGB1,为了解TNF-α在内毒素诱导HMGB1释放中的作用,进行如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠肥大细胞株P815购自中国科学院细胞库。脂多糖(LPS)、小鼠 TNF-α和羊 IgG(正常对照)为Sigma公司产品,羊抗小鼠TNF-α抗体 IgG和小鼠TNF-αELISA试剂盒为 R&D公司产品,HMGB1 ELISA试剂盒为Shino-Test公司产品,RPMI 1640和OPTI-MEM I培养液为Gibco公司产品。

1.2 方法

1.2.1 培养细胞实验 小鼠肥大细胞株P815以含10%新生牛血清的 RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2培养箱中进行培养,实验前2 h用无血清OPTIMEM I培养液置换,并调节细胞浓度为2×106/ml。诱导一定时间后,收集细胞培养上清液,保存于-20℃待测。实验均重复5次。

1.2.2 HMGB1、TNF-α含量测定 细胞培养上清液中HMGB1、TNF-α含量采用ELISA试剂盒检测,按产品使用说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件包进行双侧 t检验分析和多样本均数间两两比较(Dunnett-t检验法),P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对肥大细胞HMGB1、TNF-α释放的诱导作用

小鼠肥大细胞株P815经100 μ g/L LPS诱导后,培养上清液中HMGB1含量于6 h时显示升高,并随时间延长而进一步升高,TNF-α含量于6 h时达峰值,随后逐渐降低(图1)。通过台盼蓝细胞染色显示,100 μ g/L LPS对肥大细胞株P815未见明显细胞毒作用。

2.2 抗TNF-α抗体对LPS诱导肥大细胞HMGB1释放的影响

5、25 mg/L 抗 TNF-α抗体 IgG 对 100 μ g/L LPS诱导(24 h)小鼠肥大细胞株P815的HMGB1释放显示明显的抑制作用(P＜0.05),后者抑制率为40.1%,而正常对照IgG没有影响(P＞0.05)(图2)。

图1 脂多糖诱导后肥大细胞培养上清液中HMGB1和TNF-α含量的变化

图2 抗TNF-α抗体对脂多糖诱导肥大细胞HMGB1释放的影响

2.3 TNF-α对肥大细胞HMGB1释放的诱导作用

2、10 μ g/L TNF-α均显示能诱导小鼠肥大细胞株P815释放HMGB1,并呈时间、剂量相关性,10 μ g/L TNF-α对肥大细胞株P815释放HMGB1的诱导作用(6、12、24 h)明显强于 2 μ g/L TNF-α(P ＜0.01)(表1)。

表1 TNF-α诱导后肥大细胞培养上清液中HMGB1含量的变化(μ g/L,n=5,±s)

表1 TNF-α诱导后肥大细胞培养上清液中HMGB1含量的变化(μ g/L,n=5,±s)

与TNF-α 2 μ g/L组比较,*P＜0.01

组别 诱导时间2 h 6 h 12 h 24 h TNF-α2μ g/L 0 3.6±0.8 6.1±1.6 7.8±1.5 TNF-α10 μ g/L 0 7.6±1.8*14.6±3.1* 16.3±3.7*

3 讨论

HMGB1为一种非组蛋白,广泛分布于各种组织细胞中,主要存在于胞核,分子量约为3万道尔顿,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名。1999年,Wang等[6]发现HMGB1可以释放到胞外并介导炎症反应,为内毒素血症和脓毒症的重要炎症介质。随后诸多研究[5,8,9]表明,炎症介质HMGB1还参与关节炎、急性胰腺炎、肺炎、脑膜炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、烫伤、机械外伤、缺血再灌注损伤等的病理过程。LPS可诱导巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、上皮细胞、肝细胞等释放HMGB1[5-7],但对肥大细胞HMGB1释放的诱导作用尚未见报道。动物实验和细胞实验结果显示,LPS诱导HMGB1释放要晚于TNF-α、白介素-1等细胞因子的产生,因此,HMGB1被认为是一种晚期炎症介质[6,10]。

肥大细胞作为一种重要的机体免疫细胞,广泛分布于全身结缔组织中,不仅在超敏反应中起重要作用,也参与急慢性炎症反应。近年一些研究[1-4]显示,LPS可诱导肥大细胞释放TNF-α、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-10、白介素-13、组胺等多种细胞因子或生物活性介质。最近Passante等[11]报道RBL-2H3肥大细胞不宜用于介质释放的研究。为了探讨LPS诱导后肥大细胞是否释放HMGB1,本研究使用小鼠肥大细胞株P815实验,结果显示肥大细胞经LPS诱导后HMGB1释放明显增多,提示炎症介质HMGB1参与肥大细胞在内毒素介导的炎症反应中的作用;同时,结果也表明LPS激活肥大细胞后,诱导产生的HMGB1峰值明显晚于TNF-α,与在其它种类细胞中观察到的现象[10]一致。

细胞受LPS等激活后,胞内HMGB1因缺乏引导肽结构而不能以高尔基体/内质网途径但可通过非经典途径释放到胞外,其释放机制还未完全清楚。胥彩林等[12]研究显示核转录因子NF-κ B信号转导通路参与LPS介导多种器官组织HMGB1基因表达的调控过程,最近Kim[13]和张健[14]等报道LPS诱导HMGB1释放涉及JAK/STAT通路,但“早期”的致炎细胞因子TNF-α是否参与LPS诱导晚期炎症介质HMGB1释放过程研究甚少。Wang等[15]和Wahamaa等[16]分别报道,TNF-α诱导垂体细胞和巨噬细胞释放HMGB1,我们近年研究[17]表明LPS诱导巨噬细胞HMGB1释放与CD14、TNF-α依赖途径有关。本研究结果显示,TNF-α对肥大细胞释放HMGB1具有诱导作用,使用抗TNF-α中和抗体能部分抑制LPS诱导后肥大细胞的HMGB1释放,表明内毒素诱导肥大细胞释放HMGB1部分与TNF-α有关。

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Involvement of TNF in HMGB1 release of lipopolysaccharide-induced mast cells

YANGLan,LI Lei,XU Fei,et al.(Department of Clinical Laboratory,Wuxi Maternal and Child Health Hospital Affiliated to NJMU,Wuxi214002,China)

ObjectiveTo study the effect of TNF-αin extracellular release of high mobility groupbox 1(HMGB1)in endotoxininduced mast cells.MethodsThe concentrations of HMGB1 andTNF-αin the culture mediumwere analysed by ELISA,and the effect of anti-TNF-αneutralizing antibody with various concentrations was observed on HMGB1 release,after P815 mast cells were induced with 100 μ g/L lipopolysaccharide(LPS).HMGB1 release was investigated in P815 mast cells induced by mouse TNF-α.ResultsHMGB1 level in the culture medium time-dependently increased after mast cells were inducedwith LPS,andTNF-αlevel tended to peak 6 hours after induction.Anti-TNF-αantibody with 5 mg/L and 25 mg/L significantly inhibited LPS-induced production of HMGB1 by mast cells(P＜0.05).TNF-αdose-and time-dependently induced extracellular release of HMGB1.ConclusionEndotoxin induces mast cells to release HMGB1 partly through TNF-α-dependent mechanism.

HMGB1 protein;mast cells;endotoxin;tumor necrosis factor-alpha

R392.1

A

1007-4287(2010)07-0985-03

江苏省自然科学基金(BK2006027);教育部留学回国人员科研启动基金

*通讯作者

杨岚(1979-),女,硕士研究生,研究方向:炎症介质高迁移率族蛋白B1的基础和临床。陈国千,博士生导师,教授。

2010-01-17)