缺血预处理对大鼠局灶性脑损伤后线粒体Ca2+、细胞色素C的影响

隋小芳,范巧菊,陈桂芝

(佳木斯大学附属第一医院老年病二科,黑龙江佳木斯 154002)

缺血预处理对大鼠局灶性脑损伤后线粒体Ca2+、细胞色素C的影响

隋小芳,范巧菊,陈桂芝

(佳木斯大学附属第一医院老年病二科,黑龙江佳木斯 154002)

目的观察缺血预处理对大鼠局灶性脑损伤后线粒体Ca2+、细胞色素C的影响。方法用大鼠右侧大脑中动脉阻闭制成局灶性脑缺血模型。24只大鼠,每组8只,随机分为缺血预处理组、模型组和假手术组。缺血预处理组给予30 min预缺血,72 h再灌注,后续2 h缺血,4 h再灌注。用张均田的改良方法测定细胞色素C含量。用火焰原子吸收法检测线粒体Ca2+含量。结果缺血预处理组动物的细胞色素C、Ca2+,与假手术组相比差异显著(P＜0.05,P＜0.01),缺血预处理组与模型组相比差异显著(P＜0.05,P＜0.01)。结论缺血预处理减少线粒体释放细胞色素C,维持线粒体Ca2+稳态

脑缺血;缺血耐受;线粒体;细胞色素C;Ca2+稳态

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0994)

脑缺血耐受(CIT)由Kitagawa等[1]1990年在沙土鼠前脑缺血模型中发现,对随后的脑缺血损伤产生保护作用,虽然研究较晚,但是保护作用明确,从而为人们对脑缺血防治的认识,开辟了新的领域。本研究用Longa等[2]改良方法制成局灶性脑缺血模型(MCAO),观察缺血预处理对线粒体Ca2+、细胞色素C(CytC)的影响,进一步探讨缺血预处理(IP)发生机制。为缺血性脑血管疾病、中枢血管手术等可能的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 雄性Wistar大鼠24只,体重260±30 g,由佳木斯实验动物中心提供。动物随机分为3组:缺血预处理,在缺血再灌注前3 d行30 min的预缺血;模型组,缺血2 h再灌注4 h;假手术组。

1.2 方法

1.2.1 局灶性脑缺血模型(MCAO) 大鼠术前禁食12 h,禁水4 h。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,用烤灯维持体温在37-37.5℃。颈正中切口,暴露、剥离颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉,结扎颈总动脉、颈外动脉,于颈总动脉下方剪一切口。将一预先制作前端钝圆的鱼线,置入颈内动脉18±0.5 mm,直至大脑前动脉近端,有轻微阻力感为止。阻闭完成后鱼线抽出1 cm以恢复再灌注。

1.2.2 神经功能损伤评分 动物麻醉苏醒后,回笼,自由饮食。采用Zealonga评分法,0分:无神经系统功能缺失症状,活动正常者;1分:不能完全伸展对侧前爪者;2分:爬行时出现向左转圈者;3分:行走时身体向偏瘫侧倾倒者;4分:不能自发行走,意识丧失者。评分为0分和4分者均被剔除。

1.2.3 脑线粒体的制备 动物用乙醚深麻醉,断头处死,取出脑组织,冷生理盐水冲洗,滤纸擦干。每克脑组织加入9 ml预冷的分离介质(0.1 mol/lTris-Hcl PH=7.4,1mmol/lkcl,0.25 mol/l蔗糖)。用电动玻璃匀浆机匀浆后,制成10%匀浆,低温离心(600 g/min,4℃)15 min,取上清液低温离心(18 000 g/min,4℃)15 min,上清液为胞浆,留样(CytC测定),沉淀加少量0.1 mol/llTris-Hcl PH=7.4,1 mmol/lkcl制成线粒体悬液。用双缩脲法测定线粒体蛋白含量,各管蛋白均稀释成0.2 mg/ml。

1.2.4 CytC的测定 采用改良的张均田法测定[3]。标准曲线测定,取0.1 mmol/lCytC标准品(上海维思化学试剂有限公司)0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml加蒸馏水至1.5 ml,再加几毫克连二亚硫酸钠,520 nm测光密度值,绘标准曲线。由样品光密度值据标准曲线计算其浓度(胞浆直接测定,线粒体悬液破膜后测定)。

1.2.5 线粒体Ca2+测定 采用火焰原子吸收法。取线粒体悬液1.5 ml,置于10 ml加盖刻度试管中,加入浓硝酸5 ml,阴暗处硝化一周。然后烘箱加热,使硝酸尽量分解蒸发,加入1%氯化镧至10 ml。混匀,测吸收光密度,由标准曲线计算浓度。

2 结果

2.1 神经功能缺陷评分,缺血2 h后再灌注4 h,进行神经功能缺陷评分见表1。

表1 各组神经功能缺陷评分的比较(±s)

表1 各组神经功能缺陷评分的比较(±s)

注:与模型组比较*为P＜0.05

组别 例数 评分假手术组 8 0模型组 8 1.9±0.6缺血预处理组 8 1.3±0.5*

2.2 各组实验动物胞浆CytC、线粒体CytC和线粒体Ca2+含量见表2。

表2 各组胞浆 Cyt C、线粒体Cyt C、线粒体Ca2+的比较(±s,n=8)

表2 各组胞浆 Cyt C、线粒体Cyt C、线粒体Ca2+的比较(±s,n=8)

#P＜0.05##P＜0.01 vs sham operation group,*P＜0.05**P＜0.01 vs model group

Group Plasma Cyt C(μ mol/l) Motochondrial Cyt C(μ mol/l) Motochondrial Ca2+(μ mol/100 mg◦pro)Sham operation 282.71±33.95 12.57±3.67 127.43±33.17 Model 346.19±37.72## 8.82±1.82# 76.53±17.58##Preischemic 286.39±27.59** 12.08±2.60* 112.38±20.03**

3 讨论

本研究显示:脑缺血2 h,再灌注4 h,胞浆CytC的浓度升高,而线粒体CytC浓度相应降低,这与Fujimur等[4]报道相一致。迟发性脑细胞死亡及脑缺血损伤边缘区,细胞的死亡形式以凋亡为主[7]。脑缺血细胞凋亡的引发与线粒体CytC移位至胞质相对应[5]。线粒体CytC可通过膜通透转运孔(permeabity transition pore,PTP)开放所致的外膜破裂而释放,或者通过较大的电压依赖性阴离子通道(VDAC)而释放。Bcl-2s成员可在人造脂膜上形成离子通道。Bcl-2s也可促进或抑制VDAC的开放。CytC的再分布是caspase激活和DNA裂解的上游事件。IP时热休克蛋白HSP70显著增高,其可抑制CytC和dATP启动的凋亡蛋白酶活化因子(apoptosis protease activating factor,Apaf-1)与caspase-9复合物的形成。可以有效阻抑细胞凋亡的通路。IP时促进凋亡和抑制凋亡基因均上调。尤其Bcl-2s调控CytC的释放[6],而c-fos可通过HSP70基因表达发挥作用。Ca2+作为第二信使,其信号在胞浆、内质网、胞核和线粒体间传递,引发生物学效应。几乎参与一切调控细胞功能的信息转化过程,同时也是细胞内代谢活动的重要元素。因此维持细胞浆、细胞器、细胞核Ca2+浓度对生命活动是至关重要的。许多使PTP开放的因素都要求有Ca2+存在[8,9]。Ca2+通过与腺苷转运酶(ANT)结合改变其构象,使PTP开放。ANT与亲合素(Cyp-D)结合又增加PTP对Ca2+的敏感性,使更多的PTP开放,PTP发挥自放大效应。ADP或ATP与ANT结合能降低PTP对Ca2+的敏感性。在许多刺激因子的作用下,线粒体内Ca2+含积聚,与ANT结合增多,PTP开放数量增加,积聚的Ca2+含释放。最终细胞选择那种死亡形式,由PTP开放后细胞内ATP供应状态决定。由此我们认为,预处理调节线粒体释放细胞色素C,维持线粒体Ca2+稳态,通过此作用发挥IP的线粒体机制。IP通过不同时程、不同位点调控线粒体钙稳态及细胞色素C的释放。阐明IP的保护机制,利于进一步认识TIA发作。为颈动脉和中枢血管手术提供理论依据。

[1]Katagawa K,Matsumoto M,Tagaya M,et al.Ischemic tolerance phenomenon found in the brain[J].Brain Res,1990,528(1):21.

[2]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.

[3]张均田.现代药理学方法[M].北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1228-1229.

[4]Fujimura M,Morita Fujimura Y,Murckami K,et al.Cytosolic redistribution of cytochrome C after transient focal cerebral ischemia in rats[J].J Cere Blood Flow Metab,1998,18(11):1239.

[5]Sugawara T,Fujimura M,Morita Fujimura Y,et al.Mitochondrial release of cytochrome C correponds to selective vulnerability of hippocampal CA1 neuronsin rats after transient globe cerebral ischemia[J].J Neurosci,1999,19(22):Rc3.

[6]Yan C,Chen D et al.Overexpression of the cell death suppressor Bcl-w in ischemic brain:implications foe a neuriprotective role via the mitochondrial pathway[J].J Cere Blood Flow Metab,2000,20(3):620.

[7]Sai K,VenkatachalamMA.Role of apoptosis in hypoxic/ischemic damage in kidney[J].Semin Nephrel,2003,23(6):511.

[8]Li M,Xia T.Cadmium directly induced the opening of membrane permembility pore of mitochondrial which possibly involved in cadmium triggered apoptosis[J].Toxicology,2003,12(15):194(1-2):19.

[9]Browkes PS.Darley Usmar VM.Role of calcium and superoxide dismucase in sensition mitochondria to peroxynitrite induced permembility pore[J].Am J Physiol Heart Cire Phydiol,2004,1:286(1):H39.

Effect of ischemic preconditioning on contents of cytochrome C and mitochondrial calcium in rats after focal cerebral is- chemic-reperfusion

SUI Xiao-fang,FAN Qiao-ju,CHEN Gui-zhi.(Department of OldAge,First Affiliated Hospital ofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo observe the effect of ischemic preconditioning on contents of cytochrome C and mitochondrial calcium in rats after focal cerebral ischemic-reperfusion.MethodsFocal cerebral ischemic model was made by occlusion of right middle artery in Wistar rats(ischemia for 2 h and reperfusion for 4h).Ratswere randomly divided into three groups:preischemia、model and sham operation.Rats in preischemia group were undergone transient ischemic preconditioning(30 min)and reperfusion(72 h).The contents of cytochrome C were measured according to Zhangjuntian'simproved means.The contents ofmitochondrial calcium were detected by flame atom absorption.ResultsThe contents of mitochondrial cytochrome C and calcium in model groupwere significantly lower than sham operation(P＜0.05,P＜0.01),whereas the contentsof plasma cytochrome Cwere markly higher(P＜0.05,P＜0.01).The change in preischemia groupwas obviously difference as comparedwith the model group.ConclusionIschemic preconditioning reduced the release of mitochondrial cytochrome C and maintained mitochondrial calcium dyshomeostasis.

Cerebral ischemic;Ischemic tolerance;Mitochondria;Cytochrome C;Calcium dyshomeostasis

R743

A

1007-4287(2010)07-0994-03

2009-05-13)