组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

王忠太，马佳玲

（甘肃省康复中心医院，甘肃 兰州 730000）

组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

王忠太，马佳玲

（甘肃省康复中心医院，甘肃 兰州 730000）

目的 建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织块贴壁法。方法 采用组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法传代，并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果 90%的组织块接种存活，培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷”状生长，免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论 组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高。

平滑肌细胞；组织块贴壁法；原代培养

血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖、迁移、凋亡不足及细胞外基质沉积造成的内膜增生是动脉粥样硬化、冠状动脉支架内再狭窄、移植血管病变的主要原因。动脉平滑肌细胞培养是进行平滑肌细胞分子生物学研究的基本条件，可用于多种与平滑肌细胞生长、增殖有关的疾病发病机理及药物作用机制的研究，如动脉粥样硬化、经皮腔内血管成形术（PTCA）术后再狭窄、药物的钙通道开放（拮抗）作用、血管损伤引起钙稳态失衡等。本研究在参照国内外经验[1～3]的基础上，建立了一种简便、易行的原代培养大鼠VSMC方法。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠体重120～150g，雌雄不限，购自兰州大学GLP实验动物中心。DMEM（高糖型）培养基、胰蛋白酶粉、标准胎牛血清均购自HyClone公司。小鼠抗大鼠SM-actin单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司（中国）。青霉素钠、硫酸链霉素（华北制药厂），24孔板，10mm×10mm盖玻片，25cm2塑料培养瓶（Costar公司）及手术器材。

1.2 细胞培养

1.2.1 原代培养 SD大鼠断颈处死，放血，75%乙醇浸泡5min，移入超净工作台内，沿腹中线剖开胸腔、腹腔，剪开膈肌，翻开左侧肺叶，可见在脊柱前走行的胸主动脉。小心分离取出胸主动脉，立即置于含青霉素100U/ml，浓度100mg/ml硫酸链霉素的无菌PBS液体中。用两把眼科镊轻轻夹住血管向相反方向稍用力牵拉，呈袖套样剥除外膜。更换平皿，用PBS液漂洗2次后，纵向剖开血管，将血管内膜面朝上平铺于培养皿上，用眼科弯镊钝性刮除内膜，以去除内皮细胞。用眼科弯剪反复将其剪成1mm×1mm的组织块，边缘整齐、光滑，用弯头吸管移入并均匀贴放于25cm2培养瓶底面，间隔约5mm，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上并向瓶内加入约4ml含体积分数20%胎牛血清的培养基。然后瓶盖旋松，于CO2培养箱中静置4～6h，使组织块干涸并与瓶底贴壁附着后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置于37℃的CO2孵箱中3～7d。待有细胞从组织块周围游出后换液，以后约2～3d换液1次。

1.2.2 细胞换液 细胞换液主要根据细胞生长状况及培养液的颜色变化决定。当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变为黄色时，需换液。在超净工作台上，吸弃原培养基，用PBS液轻轻冲洗后，加入新鲜的含体积分数20%胎牛血清的培养基继续培养，也可进行半量或2/3量换液。换液时应动作轻柔，尽量不要碰到组织块。

1.2.3 细胞传代 至单层细胞铺满近培养瓶底的80%以上时即可进行传代。将原代细胞瓶内的培养液小心吸弃，加入PBS液2ml轻晃培养瓶冲洗细胞，吸弃，加0.25%（g/L）胰酶液2ml在37℃消化约40s。倒置显微镜下见细胞回缩、变圆，细胞成片收缩呈球形时，立即加入含血清培养基终止消化。然后轻轻吹打瓶壁细胞使其完全脱落，形成的细胞悬液按1∶2或1∶3接种。周期约为5～7d。首次传代时，脱落的组织块可以转移到新的25cm2培养瓶中，按原代培养方法使组织块重新贴壁。24h后可见细胞重新贴壁生长。以后约2～3d换液1次，1周左右后细胞再次长成致密单层时即可再次传代。待细胞传代至3～5代，即可用于实验。

1.2.4 细胞冻存、复苏 冻存时取对数生长期细胞，冻存前一天最好换液。消化细胞将其收集于离心管，计数、离心后弃上清液，加冻存液（DMSO、血清、DMEM 培养基以 1∶3∶6 配制），使细胞的最终密度为（5～10）×106/ml，分装入冻存管中，置4℃冰箱冷却1h后转入-20℃冰箱冷却2h，最后保存在-70℃冰箱中。复苏时从-70℃冰箱中取出冻存管，直接投入37℃水浴箱中，使其尽快融化。用吸管吸出细胞悬液，注入离心管加含20%胎牛血清的培养液，离心后弃上清液。培养液适当稀释后接种于培养瓶，放入CO2培养箱静置，次日更换培养液，继续培养。

2 结果

2．1 平滑肌细胞培养及形态学观察

原代培养第4～7d，可见少量细胞自组织块边缘游出，但不是所有的组织块周边都有，渐向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，且形态多样（梭形、多角形、星形或不规则形），大小略有差异。此后细胞呈放射性生长，至第10d，随着细胞的增殖，培养瓶内可见大量细胞平行生长铺满瓶底。部分区域细胞多层重叠，部分区域高低起伏呈“峰-谷”状生长。传代后80%～90%的细胞可重新贴壁生长，其生长方式及形态特点同前。

2.2 VSMC组织学鉴定

培养第5代的细胞经特异的SMα-actin免疫细胞化学染色后，胞浆着棕黄色，呈阳性表达。此免疫组化结果表明，所得细胞确为典型的VSMC。

3 讨论

VSMC的增殖是介入术后再狭窄发生和动脉硬化（AS）过程中的一个关键因素。在动脉粥样硬化病变的发展和血管损伤的反应中，VSMC迁移至血管壁内膜下，离开静止期G0/G1，进入细胞周期促进病变的反应[4]。因此，研究防治VSMC增殖成为血管生物学领域的热点。体外VSMC为寻找新的防治方法提供了实验模型。

研究表明，平滑肌细胞是动脉中膜唯一类型的细胞，因此主动脉中膜可作为获取平滑肌细胞的最佳来源。目前，常用的方法有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法虽然培养周期短、产量高，但胶原酶价格昂贵，且试验中污染机会大，最佳消化时间不好把握，消化酶本身对细胞有毒性作用，易消化过度导致细胞活力不佳。组织块贴壁法具有获得平滑肌细胞纯度高、量多，操作简单的优点，可避免酶消化法的上述弊端。

在培养过程中，应注意以下几点：（1）选择血管供体时，一般选用120～150g的大鼠。体重太小，血管细，操作困难；体重太大则细胞活力弱，不易生长。（2）取下胸主动脉至将组织块种植到培养瓶时间最好不要超过半小时；严格无菌操作，减少污染机会。（3）剥除血管外膜和内膜时，动作轻柔，避免用力牵扯，使细胞受伤，活力下降。（4）分离中膜时，要彻底剥离内膜与外膜，以减少内皮细胞和成纤维细胞的污染。（5）组织块大小以1mm3较为合适，边缘整齐、光滑，以利于细胞游出。注意细胞密度，一般取2～3只大鼠的胸主动脉组织块均匀接种于25ml培养瓶中，间隙约2～3mm，以保证细胞游出后有足够的生长空间并保持细胞密度的均匀。（6）组织块干涸贴壁后及时翻正培养瓶，时间约为1.5～3h。干涸时间短有利于细胞存活，但不利于贴壁。（7）及时清理漂起的组织块。可将漂起的组织块转移到新的培养瓶中重新贴壁，继续培养。（8）营养液中血清质量是关系到培养能否成功的重要因素，最好使用优质的胎牛血清，原代培养时可将血清浓度提高到25%，消化传代后营养液中血清浓度为15%。（9）一般3～5d换液1次，换液时不可将瓶内原培养液全部换掉，应保留1/3原培养液，然后加入新鲜培养液至原量。这样可使细胞保持相对稳定的体液环境，又不致缺乏营养，有利于细胞保持正常的生长速度。

[1]Wang Z，Rao P J，Castresana M R，et al.A method to isolate morphologically distinct clones of smooth muscle cells from human saphenous vein[J].Methods in Cell Science，2002，24:131～137.

[2]Lemire J M，Covin C W，White S，et al.Characterization of cloned aortic smooth muscle cells from young rats[J].Am J Pathol，1994，144:1068～1081.

[3]梁若斯，陈德.成人动脉平滑肌细胞体外培养模型的建立[J].中国现代医学杂志，2002，12（10）:31.

[4]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Narue，1993，362:801～809.

G424.31

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1671-1246（2010）03-0097-02