HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量

王乔飞

(江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500)

多维片是综合营养保健品，其成份极其复杂，不但包括各种水溶性和脂溶性维生素，还有多种补充的微量元素，其中VD3是一种脂溶性维生素，其含量极低，样品中仅约含2.5ug/g，且性质不稳定，遇光和空气均易变质、降解，而且其它杂质对其稳定性和检测都有影响和干扰，其含量测定一直是个瓶颈难题。

有关资料提供的方法，主要采用添加碱液进行皂化反应，然后采用石油醚、乙醚多次萃取，再用氮气流吹干处理。不但操作过程繁琐，而且样品的回收率不稳定，操作的重现性很差。有的方法在对样品中VD3充分溶出作了考虑，但在处理过程中缺少抗氧、防吸附，减少干扰等措施，致使成分仍有损失而回收率偏低。有文献报道，采用反相色谱系统测定，但对于脂溶性维生素采用反相系统，样品回收率不满意。

本文提供了一个实用、易操作的检测方法，无需进行皂化处理和反复萃取等繁琐操作，而是针对VD3性质不稳定，制剂成分复杂的情况，分别采取了避光、抗氧，抗干扰分离手段，取得了较好效果。特别适用痕量VD3的准确测定。该方法未见报道。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 HPLC系统，配紫外检测器。

1.2 色谱条件

色谱柱:菲罗门luna 5um silica柱 250*4.6 mm;流动相:异丙醇:正己烷(0.5:99.5);流速:2 ml/min;检测波长:264 nm;进样体积:75 uL。

1.3 试药

对照品:VD3:USP standance，Cat no:13100，Lot:MOB157

试剂:正己烷、异丙醇、二甲亚砜为色谱纯;氯化钠、抗坏血酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(APDC)为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 各试液的制备

对照品贮备溶液:精密称取60.0mg±0.1mg维生素D3对照品于一250ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为0.24mg/ml。

对照品标准溶液:精密吸取上述对照品贮备溶液用正己烷溶剂再分步稀释500倍后，得对照品标准溶液。

样品溶液制备:取5g APDC和1 g抗坏血酸，溶于1000mL DMSO中，具塞，避光保存，作为萃取溶液;取20片样品磨细，精密称取约5.0g细粉于一200mL棕色具塞锥形瓶中，加25mL萃取液，上述溶液于超声水浴机中60±3℃超声15min，取出放冷至室温，加入25.0mL正己烷，强烈振摇，再加15mL18%NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷。高速涡旋混匀约5min，再静置5min，吸取上层液体于一50mL离心管中，高速离心约5min，取正己烷上清液过滤后注入HPLC液相色谱仪。

2.2 系统适应性试验

分别制备对照品标准溶液和样品溶液，各取75μL注入液相色谱仪，分别记录对照品标准溶液和样品溶液色谱图(如下图所示)，结果VD3和其它杂质峰的分离度大于2.0，理论板数按VD3峰计算大于2500，表明该系统适应性良好。

图1 对照品标准溶液色谱图

图2 样品溶液色谱图

2.3 线性关系

精密称取维生素D3对照品，配制浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μg/mL 的溶液，分别进样，记录色谱图，色谱峰面积分别为:9.40，18.64，37.81，57.30，75.77。对照品峰面积与进样浓度作线性方程:A=97.521C-0.191，C 表示浓度，单位:mg/mL。(n=5，r=0.9999)，样品溶液浓度范围为0.1 ～0.8μg/mL。其关系如图3。

图3 工作曲线

2.4 精密度试验

2.4.1 进样精密度试验

取对照品溶液连续进样6次，记录峰面积，分别为:48.2，48.3，48.2，48.0，46.7，47.7，计算精密度，平均峰面积为 47.85(n=6，RSD=1.26%)。

2.4.2 重复性试验

取本品，照样品溶液制备方法处理，进行含量测定，重复测定6次，峰面积分别为53.86，53.25，53.66，53.45，54.07，53.59。平均峰面积为 53.59(n=6，RSD=0.62%)。重复性试验表明，本法的重复性较好。

2.4.3 中间精密度试验

在不同时间，由化验室同事照同法操作，用美国Waters 600液相色谱系统进行检测，记录色谱图，计算VD3平均含量，得VD3平均含量为2.540 ug/g，RSD 为 0.41%。

2.5 溶液稳定性试验

取2.4.2 项下样品溶液，在 0h、1h、2h、4h、6h、8h时各进样一次，记录色谱图，得VD3峰面积的RSD为0.36%，但杂质峰的总峰面积在6小时后有所增加。

2.6 回收率

分别制备含80%，100%，120%维生素D3的样品，测试回收率。结果见表1。

表1 样品回收率结果

在配方量的80% ～120%范围内，测定平均回收率为99.04%，RSD 为1.11%(n=9)，说明该测定方法准确度较好。

3 结论

由于产品中VD3含量很低，能将其充分溶解出来是实验成功的关键，本法采用万能溶剂二甲亚砜，并进行超声水浴处理，保证其充分溶出。

针对VD3遇氧不稳定，准确测量痕量VD3含量，提高其回收率，关键是处理过程中要增加稳定手段，同时，由于组分复杂，为减少干扰损失，须采取适当的分离方法。为此，本法采取了以下措施方法:(1)加入少量抗坏血酸酸抗氧化降解;(2)加入吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(APDC)对杂质离子进行络合，防干扰;(3)加入氯化钠溶液，使高分子絮凝，减少吸附损失;(4)采用正已烷对其充分萃取，起到较好的抗氧化保护作用。

通过实验显示:VD3在低于80℃时，对热稳定。故本法可采用60℃水浴加热。

由于VD3对光照不稳定，因此，在整个操作过程中均用棕色容器，避光操作。

本法测定复杂组分中的痕量VD3含量，操作简便易行，方法重现性好，回收率基本接近100%，结果准确。

［1］庄向平，唐伟虹.高效液相色谱法测定蝉蛹冻干粉中VB2、VD3 含量［J］.宁波高等专科学校学报，2001，13(3):98-100.

［2］李青.VD3测定方法的比较［J］.兽药与饲料添加剂，2007，7(6):21-22.

［3］胡晓文，裴元英.VD3微囊制备及含量测定［J］.中国药房，2008，19(1):41-42.

［4］国家药典委员会.中国药典二部［M］.北京:化学工业出版社，2005.

［5］张玫，刘新宇.HPLC测定维多宝泡腾片中VD3含量［J］.上海医药，1998 ，19(2):36-37.

［6］历士旺，张亚锋，等.HPLC法测定钙 -D颗粒剂中VD3 含量［J］.西北药学杂志，2003，18(1):3-4.