人类疱疹病毒-2对HaCaT细胞表达GCSF和GMCSF的影响

邵 勇，钟绮丽，万 峻，张 杰，张 伟，于 波

（1.北京大学深圳医院，深圳518036；2.深圳北京大学香港科技大学医学中心，深圳518036；3.暨南大学药学院，广州510632）

角质形成细胞（keratinocyte,KC）是生殖器疱疹感染人类的第一道屏障，除具有物理屏障作用外，KC还作为免疫细胞可天然地或经各种刺激诱导而产生多种细胞因子。已发现，GCSF和GMCSF具有免疫调节、促进血管新生等作用，HSV-2是生殖器疱疹的主要致病因子，但HSV-2刺激KC对该两种细胞因子的影响不明，我们通过HSV-2刺激HaCaT细胞探讨GCSF和GMCSF在生殖器疱疹发病中的作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞 人永生化表皮细胞株HaCaT细胞购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。非洲绿猴肾细胞株VERO细胞由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所段书敏教授提供。人外周血单一核细胞（PBMC）由健康志愿者提供。

1.1.2人类疱疹病毒-2型（HSV-2） 标准株由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所段书敏教授提供。

1.1.3主要试剂 PMI1640和DMEM干粉、胎牛血清、胰蛋白酶和细胞培养用青霉素-链霉素：GIBCO公司。Trizol、SYBR Green：Invitrogen公司。cDNA反转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）、tag 酶、dNTP：Fermentas。WST1 试剂盒：Takara公司。PCR引物：上海生工，引物序列GCSF：上游引物5-AGACAGGGAAGAGCAGAACG-3，下游引物 5-ATGGGAGGACAGGAGCTTTT-3，扩增片段长度为106bp。引物序列GMCSF：上游引物5-CAGCCACTACAAGCAGCACT-3，下游引物5-AAAGGGGATGACAAGCAGAA-3，扩增片段长度为115bp。

1.1.4仪器及器材 CO2孵箱（美国热电3111型），倒置相差显微镜（日本Olympus CKX41型），普通PCR仪（Bio-RAD），荧光定量PCR仪（Bio-RAD Chromo4），DNA凝胶分析系统（美国 Wealltec），酶标仪（Bio-RADModel 680型）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 HaCaT细胞与VERO细胞均培养在DMEM培养液中，另加10%胎牛血清，100U/mL青霉素和50U/mL链霉素。细胞在37℃、5%CO2条件下培养。细胞达到70%密度时进行传代，传代时去除培养液，使用DPBS润洗细胞1次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃、5%CO2条件下消化5min，消化后按照1∶10比例传代。

1.2.2HSV-2病毒扩增 HSV-2病毒计数以及HSV-2病毒感染HaCaT细胞根据文献方法进行[1]。本实验中病毒液滴度计数结果为1×107PFU/mL。感染HaCaT细胞的病毒终浓度为0.1PFU。病毒感染后3 h，更换为新鲜培养基。从加入病毒开始计时，分别培养细胞 24 h、48 h、72 h。

1.2.3总RNA提取和反转录获得cDNA 在不同时间点取感染后的HaCaT细胞，吸取培养液-80℃保存，细胞层中加入1mLTrizol试剂，根据Trizol使用方法提取总RNA。取1μgRNA进行cDNA反转录，方法根据RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行。获得cDNA后使用GAPDH引物进行PCR扩增，检测cDNA质量。PCR扩增条件如下：95℃预变性5 min，继之进行30个循环，包括 95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃延伸10 min。

1.2.4荧光实时定量PCR PCR反应体系中加入SYBR Green染料以及不同引物，进行荧光实时定量PCR反应，PCR扩增条件如下：95℃预变性5min，继之进行35个循环，包括95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s。

1.3统计学分析 采用四格表检验。

2 结果

2.1GCSF的测定 在0h、24h、48h及72h等四个时间点检测对照组和HSV-2刺激组，GCSF在不同时间点的表达量见表1。发现24h时点HSV-2刺激HaCaT细胞表达GCSF水平增高，48h时GCSF表达量与对照组相比无明显差异，随着时间延长，72h时又明显上升，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

表1 HSV-2对HaCaT细胞表达GCSF的影响 （±s）

表1 HSV-2对HaCaT细胞表达GCSF的影响 （±s）

时间（h）24 48 72对照组1.34±0.48 1.50±0.67 6.10±4.10实验组16.45±4.76 15.41±9.84 53.79±13.60 t P 5.47 2.44 5.81 0.005 0.071 0.004

图1 HSV-2对HaCaT细胞表达GCSF的影响

2.2GMCSF的测定 在 0h、24h、48h及 72h等四个时间点检测对照组和HSV-2刺激组，GMCSF在不同时间点的表达见表2，发现24h时点，HSV-2可使HaCaT细胞表达GMCSF的水平增高，48h时GMCSF略有下降，随着时间延长，72h时又大幅度上升。24h、48h及72h实验组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

表2 HSV-2对HaCaT细胞表达GMCSF的影响 （x±s）

图2 HSV-2对HaCaT细胞表达GMCSF的影响

3 讨论

表皮不仅是机体对外界环境的机械屏障，它还是一个活跃的免疫器官，几乎包括了免疫反应所必需的各种成分，如在炎症反应中起主要作用的细胞因子的产生，且与机体总的反应相一致。KC是表皮的主要成分，是一系列细胞因子的主要来源。正常或病理条件下，KC产生的大量细胞因子，在维持皮肤自稳和炎症性皮肤疾患的病理过程中具有重要作用[2]。

GCSF是一种多肽链的细胞生长因子，可特异地调节粒系细胞的增殖与分化，并能增强成熟粒细胞的功能，对机体应激防御系统有重要意义。在体内，GCSF能促进粒系祖细胞的增殖、分化及成熟，并促进骨髓中中性粒细胞和干祖细胞释放于外周血中[3]。GCSF能增强成熟粒细胞趋化性，吞噬作用及杀菌能力，促进其生存。GCSF还可促进中性粒细胞释放花生四稀酸和白细胞碱性磷酸酶及髓过氧化物酶，并介导中性粒细胞超氧阴离子的产生及抗体依赖的细胞杀伤活性(ADCC)作用[4]。Morikawa等[5]研究显示，B细胞表面有GCSF特异性受体存在。体外培养发现，GCSF可促进B细胞的增殖，但其促进B细胞分泌免疫球蛋白的作用更为显著。推测在细菌感染情况下，机体可释放有活性的GCSF，使体内GCSF的血液浓度明显升高，各种细胞包括粒细胞、单核细胞及淋巴细胞均参与炎症的反应，且分泌各种有活性的包括GCSF在内的可溶性因子，因此在炎症局部GCSF的浓度相当高，有可能达到促进B细胞增殖及分泌免疫球蛋白的作用。GCSF不仅对造血系统细胞有明显作用，对某些非造血细胞也有一定作用。体外培养发现GCSF可刺激血管内皮细胞的增生及迁移[4]。

GMCSF是目前已知四类集落刺激因子之一,在体内由内皮细胞，成纤维细胞及T细胞等产生，为一类多功能细胞因子。可刺激机体造血祖细胞增殖并分化为粒细胞、单核巨噬细胞和嗜酸粒细胞，对成熟粒细胞/巨噬细胞有延长其生成期、促进吞噬功能和释放活性物质的作用，并通过直接和间接改变细胞因子的分泌，影响细胞内及细胞间信息传递[6]。

近年来，大量实验证明KC可以产生多种参与炎症反应、调节免疫功能的细胞因子。KC正常情况下一般不产生或少量地分泌某些细胞因子，但在适宜的刺激因素作用下，KC可活化，大量地产生多种细胞因子。国外有研究显示，KC在紫外线、脂多糖等的刺激下可以分泌GCSF和GMCSF[7，8]。本实验以HaCaT细胞作为人KC的体外研究模型。文中研究结果表明，正常HaCaT细胞可以自发分泌GCSF和GMCSF，经过不同时间的HSV-2刺激，二者的分泌量均明显升高，这与国外用紫外线和脂多糖刺激相似；但从图1和图2两者表达曲线上看，随着刺激时间增加，在48h时两者的表达量稍下降，72h时又大幅度上升。本实验通过用HSV-2刺激，GCSF和GMCSF在24h时明显升高，有助于促进粒细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞及淋巴细胞的数量及生理功能，增加分泌多种炎症细胞因子，发挥抗感染免疫效应。在48h时两种细胞因子的表达量稍下降，可能是GCSF和GMCSF的衰减，或是由于其他机制的影响，分泌暂时受到抑制；在72h时两者表达量又大幅度上升，可能和各种细胞因子相互促进诱生，产生协同生物学效应有关。HSV-2刺激对GCSF和GMCSF的分泌有促进作用，说明该二者在HSV-2感染正常皮肤引起的炎症反应中可能具有重要作用。

在皮肤细胞因子网络中，HSV-2感染所引起的病理生理反应可能是这两种因子与其他因子和(或)其他机制协同作用的结果。因此，为了更好地了解HSV-2感染导致的生殖器疱疹的发病机制，还需进行全面、系统的研究，以提高对生殖器疱疹的治疗效果。

［1]Su SJ,Wu HH,Lin YH,et al.Comparative studies of types 1 and 2 herpes simplex virus infection of cultured normal keratinocytes[J].J Clin Pathol,1995,48:75-79.

［2]王岩，王刚.角质形成细胞与细胞因子[J].中国麻风皮肤病杂志,2004,20（1）：64-65.

［3]于景敏，孟志云，窦桂芳.粒细胞集落刺激因子的研究新进展[J].中国实验血液学杂志，2008,16(2):452-456.

［4]樊娟，徐功立.粒细胞集落刺激因子及其受体[J].临床血液学杂志，1999,12(3):138-140.

［5]Morikawa K，Miyawaki T,Oseko F,et a1．GCSF enhances the immunoglobulin generation rather than the proliferation of humam B lymphocytes[J].Eur J Haematol,1993，51:144-151.

［6]Begley CG,Lopez AF,Nicola NA,et al.Purified colony-stimulating factors enhance the survival of human neutrophils and eosinophils in vitro:a rapid and sensitive microassay for colony-stimulating factors[J].Blood,1986,68:162-166.

［7]付兰，何黎.UVB对角质形成细胞产生细胞因子的影响[J].国际皮肤性病学杂志，2007,33(4):231-233.

［8]Kapp A,Danner M,Luger TA,et al.Granulocyte-activating mediators (GRAM).II.Generation by human epidermal cells--relation to GM-CSF [J].Arch Dermatol Res,1987,279:470-477.