凉血活血复方对体外培养HaCaT、ECV304细胞端粒酶活性的影响

刘晓明，李玉锋

（大连医科大学附属第一医院，大连 116011）

银屑病的主要特征为表皮过度增生，真皮乳头微血管扭曲扩张管壁增厚，通过抑制表皮过度增殖、抑制新生血管形成已成为治疗银屑病的新方向[1]。临床上很多药物是通过抑制角质形成细胞的异常增殖、诱导角质形成细胞凋亡或是通过抑制血管新生而达到治疗银屑病的目的。但化疗药物具有多种不良反应。中医中药在治疗银屑病方面积累了不少经验，曾有学者整理分析出几十味使用频率较高的中药[2]。凉血活血复方是我科在前人的研究基础上通过拆方分析和动物实验反复筛试得到的，具有凉血、活血、清热、养血、祛风的功效。通过临床观察试验，该复方治疗寻常性银屑病4周时有效率达65%，治疗8周时有效率达78%，疗后PASI评分较疗前显著降低（P＜0.01）[3]。本研究以体外培养的人永生化表皮细胞（HaCaT细胞株）及脐静脉内皮细胞（ECV304细胞株）分别模拟表皮角质细胞增殖过快及乳头部微血管变化。在确定了该复方具有抑制HaCaT、ECV304细胞增殖，诱导凋亡的前提下，将不同浓度的凉血活血复方水醇粗提液分别作用于体外培养的HaCaT细胞株、ECV304细胞株，观察凉血活血复方提取物对HaCaT细胞株、ECV304细胞株增殖抑制、细胞凋亡以及端粒酶活性等方面的作用,旨在探讨凉血活血复方提取物抑制细胞增殖、诱导凋亡的可能途径及其抗银屑病作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 人永生化表皮细胞HaCaT细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，人脐静脉内皮细胞ECV304细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所，TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA端粒酶活性检测试剂盒购自罗氏公司，其他常规化学试剂购自大连化学有限公司。

1.2方法

1.2.1凉血活血复方的组成及药液的制备 凉血活血复方由大青叶 15g，生地30g，黄芩12g，紫草9g，丹参 12g，赤芍 6g，牡丹皮 9g，当归 12g，土茯苓30g等组成。

将上述中药复方加10倍量蒸馏水于砂锅中浸泡30 min，煎煮2 h，用纱布过滤药液，取滤液；药物残渣加五倍蒸馏水煎煮1.5 h，纱布过滤，取滤液。合并两次滤液，用旋转蒸发仪将之浓缩为100 mL。加3倍95%乙醇4℃过夜，在低温超速离心机中20 000 r/min 4℃离心10 min，取上清。旋转蒸发仪回收乙醇至尽，并将药液浓缩成每mL相当于原中药材1g的糊状药液，0.22μm超滤膜过滤除菌，分装到5mL离心管密封，4℃冰箱保存备用。细胞培养时用含10%的胎牛血清的培养液稀释到相应终浓度（分别为 5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL、400 mg/mL），并将其pH值调到7.0±即可。

1.2.2细胞培养 将HaCaT细胞株及ECV304细胞分别以1×107/mL接种于含有10%胎牛血清的MEM培养液及RPMI1640培养液（pH7.4）中，置5%CO2细胞恒温培养箱内37℃贴壁培养。隔天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态，细胞长满则用0.25%胰蛋白酶消化细胞收集并传代或是液氮下冻存。实验选用换液24 h后对数生长期的细胞。

1.2.3TRAP-ELISA法检测细胞的端粒酶活性 端粒酶试剂盒（Boehringer Mannheim Co.Cat.No.185466），它将是一种生物素化的引物引入端粒重复放大程序（Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP）TRAP法中并用ELISA法测定PCR产物。简言之，在含反应混合物（包括生物素标记的P1-TS引物和P2引物、Taq酶等）的反应试管中进行TRAP反应，进而用酶标法测定扩增产物。

HaCaT细胞、ECV304细胞按1×106/mL接种于六孔板中至对数生长期，根据MTT实验结果和流逝细胞仪检测结果，分别选择50mg/mL、20mg/mL、10 mg/mL的复方药物溶液作用于HaCaT细胞、ECV304细胞24h，同时以只含培养基的细胞作空白对照。达到作用时间后收集2×105个细胞，4℃3 000 r/min离心10 min，弃上清。加入200 μL预冷的PBS重复离心后弃上清，以200 μL预冷的细胞裂解液重新悬浮细胞，冰浴30 min使细胞充分裂解，4℃下14 000 r/min离心20 min后，吸取上清液立即进行反应。细胞提取物经65℃热处理10 min作为阴性对照，阳性对照为永生化的人胚肾细胞（293细胞株）提取物。整个收集过程在冰上进行。

使用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA端粒酶活性检测试剂盒（Roche,Germany）进行端粒酶活性的检测，所有实验用品都要经过0.1%DEPC水处理，高压灭菌，整个操作过程都要戴手套。严格按照说明书进行如下步骤：在0.5mL Eppendorf管中依次加入25 μL反应混合液（含生物素标记的PS、TS引物、Taq酶、dNTP 等）、2 μL 细胞提取液，加水至50μL总反应体系。将反应管置于PCR扩增仪中进行以下延伸/扩增反应：①引物延伸：25℃30 min；②端粒酶灭活：94℃5 min；③PCR扩增：94℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 30 个循环；④后延伸：72 ℃10min，保温于4℃，终止反应。取5μLPCR扩增产物，加入20 μL变性液，室温孵育10min，变性后加入杂交液225 μL充分混匀，取100 μL混合液包被于抗地高辛标记的酶标板上，37℃摇床300 r/min杂交2 h，吸除杂交液，充分清洗后，加入过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体100 μL，室温下（20℃）300 r/min孵育30 min，吸除抗体，充分清洗后，加入100μL的TMB底物室温下300 r/min进行显色反应15 min后，加入100 μL终止剂终止反应，并于30 min内用酶标仪测定其在450 nm（参考波长为690 nm）处的吸光度（A450，>0.2为阳性），作端粒酶活性的定量分析。

1.3统计学处理 用SPSS12.0软件进行分析处理，采用单因素方差分析，数据以x±s表示，组间数据应用t检验分析评价。

2 结果

10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL 的凉血活血复方作用48 h，HaCaT细胞、ECV304细胞的端粒酶活性与未加药的对照组相比均受到显著抑制（P<0.01），且随药物浓度增加，抑制作用逐渐增强。各加药组与对照组在统计学上有显著性差异，且各加药组之间差异有统计学意义（P<0.01）。见表1、图1、2。浓度为 10 mg/mL、20 mg/mL、50mg/mL 的凉血活血复方与未加药组HaCaT细胞和ECV304细胞的端粒酶活性相比，分别下降了10.0%、23.8%、48.9%和13.11%、32.87%、62.11%，下调水平随药物浓度的增加而升高。

表1 凉血活血复方作用48h对HaCaT、ECV304细胞端粒酶活性的影响

图1 不同浓度复方作用48h对HaCaT细胞的端粒酶活性变化

图2 不同浓度复方作用48h对ECV304细胞的端粒酶活性变化

3 讨论

端粒酶是一种核糖核苷酸蛋白酶。人体端粒酶主要作用是维护和修复真核细胞染色体线性DNA序列，维持端粒长度的稳定性；其中端粒酶RNA（TR）和端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶发挥作用的核心组分，它可以合成端粒的重复序列并连接到染色体末端,从而维持端粒长度。正常体细胞在出生后不久即不再表达端粒酶,但在人体的永生细胞及肿瘤细胞中可有端粒酶激活并使端粒延长,有效地防止细胞老化及死亡。最近研究表明,在某些非恶性皮肤病中如银屑病患者皮损处端粒酶呈高表达。程浩等[4]采用TRAP-ELISA方法,检测20例寻常性银屑病患者,有18例皮损中端粒酶活性为阳性。由此提示银屑病皮损中端粒酶活性的增强可能与银屑病的发病机制有关。刘晓明等[5]应用TRAP-ELISA法检测了30例银屑病患者末梢学PBMC的端粒酶活性，并确定其活性与疾病严重程度呈正相关。那么是否能够研发出一种药物可以抑制端粒酶的活性而改变端粒的长度，从而导致染色体的重组或融合，加速细胞的凋亡，以抑制细胞的过度增殖，达到治疗银屑病的目的。在凉血活血复方可以抑制人永生化表皮细胞株HaCaT细胞增殖，促进其凋亡的前提下，从端粒酶活性入手观察不同浓度凉血活血复方水醇粗体液对人永生化表皮细胞株HaCaT细胞端粒酶活性的影响，以进一步揭示凉血活血复方抗角质形成细胞增殖及其抗银屑病作用的可能机制。结果显示，凉血活血复方可以显著地下调HaCaT细胞和ECV304细胞的端粒酶活性。浓度为10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL的凉血活血复方与未加药组HaCaT细胞和ECV304细胞的端粒酶活性相比分别下降了10.0%、23.8%、48.9%和13.11%、32.87%、62.11%，且下调水平随药物浓度的增加而升高。各加药组与对照组相比在统计学上差异有显著性，且各加药组之间差异有统计学意义（P<0.01）。

关于端粒酶活性与细胞周期变化、凋亡的因果关系，目前研究颇有争议。Jiang等[6]研究喜树碱对人白血病HL-60细胞有诱导凋亡的作用，同时伴有端粒酶活性的下调，认为端粒酶活性的下调不是喜树碱直接作用的结果，而是与喜树碱诱导的HL-60细胞凋亡有关。Zhu等[7]对肠癌、乳腺癌等的研究同样表明，肿瘤细胞端粒酶活性依赖于细胞周期，细胞进入G1/S期端粒酶活性逐渐升高，至S期达最高水平，在G2/M期明显降低并达最低点。细胞周期抑制药物能够抑制端粒酶活性，此结果提示端粒酶活性表达主要作用于DNA合成期，在细胞周期的其他时相，其活性可能受到基因产物的抑制。而Liu等[8]其他研究表明salvicine有道德HL-60细胞凋亡依赖于端粒酶活性的下降，端粒酶活性的下调不是细胞凋亡的产物，而可能是细胞凋亡的条件。本研究结果表明凉血活血复方水醇粗提物不仅可以在诱导ECV304细胞凋亡的浓度下（20mg/mL，50mg/mL）显著下调细胞的端粒酶活性，而且可以在低于诱导细胞凋亡的浓度下（10mg/mL）下调端粒酶的活性，提示凉血活血复方对ECV304细胞端粒酶活性的下调作用可能先于该细胞凋亡的发生，可能是细胞凋亡的前提条件。而凉血活血复方对HaCaT细胞的作用却不能支持此结论。因此，细胞凋亡和端粒酶之间的因果关系有待进一步探讨。而凉血活血复方的抗银屑病作用可能是通过下调微血管内皮细胞的端粒酶活性从而抑制内皮细胞增殖、诱导其细胞凋亡，同时作用于角质形成细胞，抑制其增殖、诱导细胞凋亡，以多靶点的形式达到抗银屑病的作用。

［1]Creamer D,Sullivan D,Bicknell R.Angiogenesis in psoriasis[J].Angiogenesis.2002,5:231-236.

［2]汤臣康，陈光娟.复方中药治疗银屑病现状与问题[J].黑龙江中医药，1998，(2)：54-57.

［3]侯素春,刘晓明,杨国玲,等.凉血活血复方治疗银屑病[J].中华皮肤科杂志,2003,36（6）:352.

［4]程浩,茅晓,张行,等.银屑病患者皮损中端粒酶活性的测定[J].中华皮肤科杂志,1998,31(2):72-74.

［5]Liu X,Lin J,Wang L,et al.Telomerase activity in peripheral blood mononuclear cells of psoriatic patients correlate with disease severity[J].Br J Dermatol,2008,158:637-639.

［6]Jiang JF,Liu WJ,Ding J.Regulation of telomerase activity in camptothecin-induced apoptosis of human leukemia HL-60 cell[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21：759-764.

［7]Zhu X，Kumar R，Mandal M，et al.Cell cycle-dependent modulation oftelomeraseactivityintumorcells[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:6091-6095.

［8]Liu WJ,Jiang JF,Xiao D,et al.Down-regulationg of telomerase activity via protein phosphatase 2A activation in salvivine-induced humanleukemiaHL-60cellapoptosis[J].BioChemPharmacol,2002,64:1677-1687.