利用重组HPV16L1蛋白检测鲍温病和鲍温样丘疹病血清中的抗体

唐 旭，沈 宏，刘继峰，许爱娥

（杭州市第三人民医院，杭州 310009）

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）具有强烈的嗜上皮性，可以引起被感染细胞的显著增殖甚至恶性转化。近年来的研究表明高危型HPV的感染与外生殖器部位表皮内新生物（又称鳞状表皮内损害）的发生密切相关，在临床上具有进展为浸润性鳞癌潜能的病变，这些新生物包括鲍温样丘疹病、鲍温病、Queyrat增殖性红斑等。

调查研究显示鲍温样丘疹病、鲍温病与HPV的感染，尤其是黏膜型HPV密切相关[1]。对于HPV这种外源性微生物，机体免疫系统的作用决定了病毒被清除还是在体内长期存活并引起相关肿瘤的发生。

本研究采用大肠杆菌表达重组HPV16型L1蛋白，经柱层析法获得纯化抗原，利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测鲍温样丘疹病和鲍温病血清中的抗体，以了解机体的抗病毒体液免疫反应，临床上为鲍温样丘疹病和鲍温病的血清学诊断与监测提供参考，从而为进一步开发HPV相关皮肤恶性肿瘤高危人群的诊断试剂盒提供前沿基础研究。

1 材料与方法

1.1临床资料 临床上收集我院皮肤科50例鲍温样丘疹病和30例鲍温病患者局部组织皮损和血清，所有病例均经临床和组织病理确诊。50例鲍温样丘疹病中，男29例，女21例，年龄19～45岁，平均年龄35.2岁，病程1个月～3年。30例鲍温病中，男16例，女14例，年龄36～88岁，平均年龄65.4岁，病程1～7年。50例正常对照血清来自我院保健科，男25例，女25例，年龄20～75岁。

1.2材料与试剂 pUCL1-25-2质粒（含HPV16L1完整的编码序列）、pET32a质粒、感受态细胞BL21、HPV16L1 IgG抗体阳性宫颈癌患者血清均由中国疾病预防控制中心病毒所朊病毒室提供；HPV16L1 IgG小鼠单克隆抗体、酶标羊抗小鼠IgG抗体，均为Santa Curz公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为北京中山公司产品；镍柱Ni-NTA Agarose购自Pharmacia公司。BCA试剂盒购自上海生工公司。

1.3实验方法

1.3.1HPV DNA检测及分型 提取皮损组织的DNA，利用引物 MY11:5′-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3′，MY09:5′-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3′扩增 HPV L1 片段，94℃ 30s，55℃40s，72℃90s共30个循环。同时设内对照。PCR产物通过RsaⅠ、PstⅠ、HaeⅢ内切酶分型,2%琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物。

1.3.2HPV16L1基因的克隆和测序 设计上游引物序列：5′AGA TCT TTA TTT AAT AGG GCT GGT ACT G 3′，下游引物：5′GTC GAC TAC ATA CAA TAC TTA CAG CTT ACG 3′，以 pUCL1-25-2 质粒为模板进行PCR扩增，扩增片段1 535bp。产物回收后与pGEM-T载体连接构建重组质粒pT-L1,序列检测由上海生工公司完成。

1.3.3HPV16L1基因表达载体的构建 连接产物用HindⅢ和 BglⅡ双酶切后与融合表达载体pET32a连接，加入感受态细胞BL21中，热休克后加LB培养基，振摇，离心去上清，重悬菌体，涂于含有氨苄青霉素和X-gal及IPTG的LB平板上，37℃培养过夜。挑取阳性菌落经酶切鉴定后进行诱导表达。

1.3.4HPV16L1重组蛋白表达、纯化和鉴定 将转化了重组表达质粒的BL21大肠杆菌接种到LB培养基中，37℃振荡培养至A600=0.5～0.7，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导约3h。Ni-NTA Agarose亲和层析柱的平衡、蛋白的纯化、洗脱按照试剂说明进行。蛋白的电泳、转膜按常规方法进行。纯化后蛋白质含量的测定采用BCA试剂盒法。

1.3.5ELISA法检测鲍温样丘疹病和鲍温病患者血清中的HPV16L1 IgG抗体 复孔包被纯化后的蛋白，脱脂奶封闭2h，加入稀释后的待检血清37℃2h，同时设空白、阳性及阴性对照。加入1:50 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 37℃2 h，加入底物和底物液显色30 min。2 moL/L H2SO4终止反应，于450 nm测吸光度。所有血清标本均重复2孔检测，读取均值。本实验Cut off值（阳性反应阈值）=正常对照血清平均A值+2SD。

1.4统计学处理 SPSS10.0统计软件分析实验数据，计数资料比较采用χ2检验，相关分析采用Kappa分析。

2 结果

2.1HPV DNA的检测及分型结果 50例鲍温样丘疹病有32例经PCR扩增出约450bp产物，30例鲍温病有14例扩增出约450bp产物。RFLP方法分析后，32例鲍温样丘疹病中28例为HPV16型；3例为HPV6型；1例为HPV31型；14例鲍温病有12例为HPV16型，2例为HPV18型。

2.2HPV16L1重组蛋白的表达及纯化 pET32a-HPV16L1重组表达质粒在大肠杆菌诱导表达的菌液经SDS-PAGE电泳显示在相对分子量约66kD处有一浓染蛋白条带 (载体上的标签约为20kD，HPV16L1蛋白约为46kD)，而未经IPTG诱导的菌体蛋白在此处表达很弱。经Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化后，获得纯化的融合蛋白，见图1，蛋白质印迹可见被鼠抗HPV16L1单抗识别，见图2。

2.3ELISA法检测鲍温样丘疹病和鲍温病血清中的HPV16L1 IgG抗体 根据阳性对照血清确定抗原最佳包被量为100ng/孔和血清最佳工作浓度为1:100。ELISA检测结果显示鲍温样丘疹病血清中HPV16L1蛋白抗体的检测率为（20/50）40%，鲍温病血清中HPV16L1蛋白抗体的检测率为（8/30）26.7%，正常献血员组检测率为（2/50）4%。见表1。这两组分别与正常献血员组比较有统计学意义（χ2=18.8，P<0.05；χ2=8.8，P<0.05）。本研究中，鲍温样丘疹病HPV16 DNA阳性组，血清HPV16抗体的检出率为71.4%（20/28）。鲍温病HPV16 DNA阳性组，血清HPV16抗体的检出率为66.7%（8/12）。两组HPV16 DNA阴性组均未检测到抗体。两组HPV16 DNA PCR法与血清HPV16抗体检测法有较好的一致性（Kappa=0.713，P<0.05；Kappa=0.676，P<0.05）。

图1 HPV16L1蛋白纯化SDS-PAGE电泳图

图2 Western-blot鉴定重组HPV16L1蛋白

3 讨论

鲍温样丘疹病好发于年轻人，皮损位于生殖器及肛周等部位，有自愈倾向，少数老年患者可进展为浸润性鳞癌。鲍温病好发于中老年人，皮损好发部位除外生殖器及肛周以外还可见于躯干四肢，病程较长缺乏自愈倾向，其进展为浸润性鳞癌的潜能高于鲍温样丘疹病。研究显示鲍温样丘疹病与生殖器部位鲍温病的HPV DNA阳性率为70%～92%，主要是HPV16型[1，2]。我们检测了50例鲍温样丘疹病有32例HPV DNA阳性，其中28例为HPV16型，表明HPV16的感染与鲍温样丘疹病的发病密切相关；30例鲍温病有14例阳性，12例为HPV16型，这也表明HPV16的感染与鲍温病的发病相关。

对于HPV这种外源性微生物，机体免疫系统的作用决定了病毒被清除还是在体内长期存活并引起相关肿瘤的发生。目前HPV的检测方法存在操作复杂、样品间易发生交叉反应、存在假阳性率等缺点，更重要的是检测难以自动化，不适宜大规模临床筛查。酶联免疫吸附试验是目前公认的较为经济、简便，适宜大规模自动化操作的检测HPV方法。近年来，由于基因重组蛋白表达的成功，使得相关的体液免疫研究得到深入和发展。

L1蛋白是HPV天然病毒颗粒结构的主要成分，具有自我组装成病毒样颗粒（virus like particle,VLP）的功能，L1蛋白的构象表位具有型特异性，可以诱导机体产生相应的中和抗体。目前用于体外表达L1蛋白的载体系统有原核和真核细胞表达系统，但真核细胞表达产量低，难以纯化且成本高，这在一定程度上限制了其在临床上的大规模应用。而原核表达系统具有表达产量高，易于纯化和成本低等优点，其表达的融合蛋白除具有线性免疫表位外，还有VLP相关的立体构象免疫表位[3]。目前国外研究已证实大肠杆菌高效表达的HPV16L1蛋白可形成病毒衣壳的五邻体组装单位，尚未组装成完整的病毒样颗粒，但其免疫原性和免疫反应性与VLP相同，完全可以代替用于检测抗原和疫苗设计[4]。国内有研究已证实在大肠杆菌中能高效表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白，并具有较好的抗原性[5]。Sehr等[6]人研究发现利用原核系统表达的HPV L1融合蛋白作为抗原，与目前HPV L1血清学检测的“金标准”——VLP-ELISA法比较，具有相似的敏感性和特异性。有研究者用人工合成HPV L1共同保守序列短肽，免疫形成的抗血清能与多型别HPV L1发生反应，用这种多价HPV抗短肽血清ELISA方法进行HPV检测，为宫颈癌的筛查和尖锐湿疣的诊断提供了有力的根据[7]。

目前国外研究者对HPV血清学检测研究很多，Bonito 等[8]利用原核系统表达 HPV16L1，L2，E4，E6，E7蛋白，以此为抗原，用ELISA检测巴氏涂片异常的患者血清，结果显示大部分血清反应阳性，82%的患者血清提示有HPV16感染。我们利用原核表达系统和镍柱亲和层析获得了较纯的HPV16L1蛋白。ELISA检测结果显示鲍温样丘疹病血清中HPV16L1蛋白抗体的检测率为（20/50）40%，鲍温病血清中HPV16L1蛋白抗体的检测率为（8/30）26.7%，并与正常献血员组比较有统计学意义。本研究中，鲍温样丘疹病HPV16 DNA阳性组，血清HPV16抗体的检出率为 71.4%（20/28）。鲍温病HPV16 DNA阳性组，血清HPV16抗体的检出率为66.7%（8/12）。两组HPV16 DNA阴性组均未检测到抗体，表明机体感染HPV16后大多数患者能产生特异性抗体，可用于HPV16感染血清学诊断的一个标志，为临床上进一步开发HPV相关皮肤恶性肿瘤高危人群的诊断试剂盒提供前沿基础研究。

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［3]栾怡，于修平，宋长芹，等，利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比[J].中国病毒学，2002,17(4):308-311.

［4]Chen XS,Garcea RL,Goldberg I,et al.Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16[J].Mol Cell,2000,5:557-567.

［5]安静，包红，周旭.人乳头状瘤病毒16型L1蛋白的高效表达及抗原性分析[J].微生物学免疫学进展,2008,36(1):14-18.

［6]Sehr P,Muller M,Hopfl R,et al.HPV antibody detection by ELISA with capsid protein L1 fused to glutathione S-transferase[J].J Virol Methods[J].2002,106:61-70.

［7]姜波玲，肖长义，叶红，等.一种多价的HPV L1抗短肽血清用于多型HPV阳性临床标本筛查的初步探讨 [J].中国卫生检验杂志,2009,19(4):746-764.

［8]Di Bonito P,Grasso F,Mochi S,et al.Serum antibody response to Human papillomavirus(HPV)infections detected by a novel ELISA technique based on denatured recombinant HPV16L1,L2,E4,E6 and E7 proteins[J].Infect Agent Cancer,2006,8:1-6.