InnVit基因对永生化黑素细胞B10BR迁移的影响

周妙妮，林福全，关翠萍，傅丽芳，洪为松，许爱娥

（1安徽医科大学杭州市第三人民医院，杭州 310009；2浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018）

Vit-1基因由Le Poole等[1]于2001年首次证实在白癜风患者黑素细胞中表达量明显下降，项目组前期研究表明中国人白癜风患者黑素细胞中该基因表达下降，但克隆的基因较Le Poole等报道的Vit-1基因缺少81个碱基的内含子，命名其为InnVit基因[2]。序列分析表明Vit-1基因含有F-box基序，为F-box蛋白家族成员。该蛋白家族在泛素-蛋白酶体途径中起着底物蛋白选择的作用[1，3]，可使与之结合的底物蛋白进入泛素-蛋白酶体降解途径，是一类参与转录调节和细胞周期等许多生理活动的关键调节蛋白[4]。因此，该基因可能在多个方面影响黑素细胞的生物学功能。

文中通过分析抑制和过表达永生化黑素细胞B10BR中的InnVit基因后细胞迁移能力和基质金属蛋白酶 2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）活性的变化，探讨该基因对黑素细胞迁移的影响，为全面了解其对黑素细胞生物学活性的调控提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料 F12培养基，L-Glutamine、马血清、TPA、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰蛋白酶、双抗、限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、lipofectamineTM 2000均购自美国Gibco公司；TRIZOL、StealthTM RNAi购于美国Invitrigen公司；Access RT-PCR system试剂盒，人MMP2、MMP9定量检测试剂盒购于美国Promega公司；Transwell小室（8.0μm）购自美国Corning公司；基质金属蛋白酶明胶酶谱法电泳分析试剂盒购于上海杰美基因医药科技有限公司；r-Taq DNA聚合酶购于Takara公司；其他常规生化试剂购于上海生工生物技术有限公司。1.2方法

1.2.1细胞培养 永生化黑素细胞B10BR由本实验室保存。复苏后细胞采用含10%马血清、100U/mL双抗、2mmol/L L-Glutamine、50ng/mLTPA 的 F12培养液，于37℃、5%CO2条件下常规培养。实验选用对数生长期细胞，转染前细胞用不含双抗培养基常规培养24h。

1.2.2细胞转染 HindⅢ和BamHⅠ双酶切InnVit基因PCR产物后，克隆至表达载体质粒p3XFLAGCMV-10的HindⅢ/BamHⅠ双酶切位点，获得InnVit基因表达载体P3XF-P120。

SiRNA由Invitrogen公司根据InnVit基因序列设计，用体外化学物合成。SiRNA1(Fbxo11-MSS212759):5′-AGA UCU UGU UCU CUA UGA ACU GUC C-3′,siRNA1(Fbxo11-MSS212759):5′-GGA CAG UUC AUA GAG AAC AAG AUC U-3′。

收集对数期生长的细胞，以1×105个细胞的密度接种6孔板，加入2 mL完全培养基，置37℃，5%CO2培养箱中培养；待细胞长至70%～80%融合，进行转染。质粒转染采用常规的磷酸钙转染法进行转染，其转染方法按Molecular Cloning[5]要求操作。SiRNA用lipofectamineTM2000进行转染，其转染方法具体参照试剂盒说明书进行。

1.2.3半定量RT-PCR检测转染效率 转染24 h后，参照TRIZOL试剂说明书提取各组细胞总RNA，以1μg的RNA模板量进行逆转录反应后，引物 InnVitm-F/InnVitm-R（5′-CATTAAGAAGTGCCA TCA-3′/5′-GTTACAATGGCAGGACTT-3′） 扩增InnVit基因，引物 Actinm-F/Actinm-R（5′-TGGAAT CCTGTGGCATCCATGAAA-3′/5′-TAAAACGCAGC TCAG TAACAGTCCG-3′）扩增内参照Actin基因，2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定PCR产物，Bio-Rad（ChemiDocTM XRS）凝胶成像分析系统分析目的基因表达水平。

1.2.3Transwell Transwell小室下层涂 1%Fibronectin，用无血清培养液平衡过夜。细胞转染后24h，收集各处理组细胞，分别计数，用无血清培养基（含1%BSA）调整各组细胞浓度为1.0×106。小室下层加入600μL完全培养基，上层加入100μL无血清培养基细胞悬液，放入培养箱培养。20h后，用棉签仔细擦拭小室上层细胞，4%多聚甲醛10min固定下层细胞，去离子水清洗2次，2min/次。自然风干小室滤膜后，0.1%结晶紫染色10min，去离子水清洗3次以上，用棉签再次擦拭上层残留细胞，显微镜下观测滤膜下层细胞并观察计数。切下滤膜，用33%乙酸将膜上结晶紫染料脱下，用酶标仪在570nm处检测各组洗脱液的A值。实验重复3次，结果以x±s表示。

1.2.4MMP-2和MMP-9活性检测 6孔板各组细胞生长至90%融合，每孔加入无血清培养液600μL，培养 16h，收集细胞培养上清液，4℃，10 000 g离心5min，备用。各组细胞培养上清用BCA法进行细胞定量，每孔上样量控制在15～20μg。明胶酶谱分析具体操作参考基质金属蛋白酶明胶酶谱法电泳分析试剂盒说明书。条带分析使用Bandscan5.0软件，活性（%）＝（处理组/对照组）×100%。

1.3统计学分析 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，P<0.05代表有统计学意义的显著性差异。

2 结果

2.1转染细胞中InnVit基因mRNA表达的变化 细胞转染24h后，用半定量RT-PCR的方法检测转染细胞中InnVit基因的mRNA水平。结果表明P3XF-P120处理组的InnVit/Actin灰度比值较未转染对照组显著升高（P<0.05）；而SiRNA抑制组的InnVit/Actin灰度比值则较未转染对照组有显著下降（P<0.05）。见图1。

图1 细胞转染后InnVit基因mRNA表达

2.2转染后细胞迁移能力的变化 转染后细胞转入Transwell小室20h后，滤膜下层细胞用结晶紫染色，镜下观察，各组迁移至下层细胞数无显著变化，见图2。用33%乙酸洗脱结晶紫染料，在570nm处检测滤膜结晶紫洗脱液的A值，结果各组结晶紫洗脱液A值无显著性差异，细胞迁移能力无明显改变，见表1。

图2 转染后细胞迁移能力的Transwell分析（结晶紫染色×40）

表1 Transwell结晶紫洗脱液A值

2.3MMP2和MMP9活性检测 各组细胞无血清培养基中培养16h后，收集培养液上清，用明胶酶谱试剂盒检测细胞上清液中的MMP2和MMP9活性。结果在蓝色背景上出现两条白色消化条带，分别为活化的MMP9和MMP2条带。用Bandscan5.0对条带进行扫描分析，结果各处理组细胞的MMP2和MMP9活性没有显著性差异（P<0.05），见图3。

图3 处理后细胞MMP2和MMP9的活性

3 讨论

InnVit基因即内含子部分缺失的Vit-1基因。最近，Vit-1基因被证实与FBXO11基因表达基序相同[6]，其N端编码一个F-box家族成员共同具有的F-box元件。F-box蛋白是在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族[3]。在蛋白质降解的过程中，由Skp1、Cullin、Rbx1/Roc1/Hrt1和F-box家族的一员组成的SCF复合体能使蛋白底物通过磷酸化的方式被蛋白酶体降解，从而调控体内各种蛋白的平衡。如果SCF复合体中的任何部分出现异常，将引起体内一些蛋白的降解障碍，进而导致生理功能调节的失常。

InnVit基因已经被证实在白癜风患者表皮黑素细胞中表达显著少于正常水平，而白癜风患者的黑素细胞则具有一些形态学和生理学的异常，如黑素小体区域化、内质网膨胀、生长迟缓等[7，8]。当对黑素细胞系B10BR的FBOX11基因进行基因沉默后，B10BR也出现内质网膨胀的现象[9]。因此，我们认为InnVit基因异常可导致黑素细胞内一些蛋白的泛素化降解异常，导致底物蛋白不能及时被降解清除，而在内质网内过度积累，从而引起各种一些生理学功能的异常。

基质金属蛋白酶（MMP）是一类依赖钙、锌等离子的内肽酶，无活性的基质金属蛋白酶原经氨基末端切除后可转化为活性状态，降解细胞外基质的主要成分，如胶原、明胶、纤维蛋白，使细胞易于迁移。MMPs活性增强，可加速细胞周围基质的降解，使细胞迁移能力和迁移范围增加。

文中将永生化黑素细胞B10BR细胞中的InnVit基因进行抑制和过表达，研究该基因对黑素细胞迁移能力的影响。结果发现，InnVit基因抑制和过表达20h后，迁移至Transwell滤膜下层的细胞数没有明显差异，即对黑素细胞的细胞迁移能力没有明显的影响。检测转染后黑素细胞MMP9和MMP2的活性，相较正常对照组也无显著性的差异。因此，InnVit基因虽然可能在多个方面影响黑素细胞的生物学功能，但对迁移相关蛋白MMP2和MMP9的正常代谢无明显调控作用，该基因的抑制和过表达对黑素细胞的迁移无明显影响。

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