寻常型天疱疮患者及一级亲属抗体IgG亚型检测

张国学，王俊秀，樊翌明，吴志华

（广东医学院附属医院，湛江524001）

寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris,PV）是一种慢性、复发性、自身免疫性大疱病，以表皮内水疱和棘层松解为特征，由自身抗体IgG介导[1]。病因迄今未明，现已明确天疱疮抗原Dsg为桥粒的跨膜成分，分为Dsg1、Dsg2、Dsg3三个亚型；目前的研究认为 Dsg1、Dsg3分别为落叶型天疱疮（pemphigus foliaceus,PF）和PV的靶抗原。Dsg3相对分子质量约130 kD，Dsg1约160 kD。抗体IgG分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 四个亚型。Bhol等[2]发现 PV 患者活动期以IgG4为主，缓解期则以IgG1为主，认为PV的致病性抗体为IgG4。研究表明遗传因素也是天疱疮发病的一个重要因素。Ahmed等[3]在31例天疱疮患者的120位一级亲属中，发现48%可检出低滴度PV自身抗体。因此，检测PV患者及其一级亲属血清中PV-IgG亚型分布及其与Dsg1、Dsg3反应性，不仅有助于进一步阐明本病的发病机制，而且可为本病的诊断和疗效观察提供理论依据。

1 材料和方法

1.1研究对象

（1）PV患者组：27例PV患者均为我院皮肤科住院患者，经临床、组织病理及免疫病理确诊；其中男 14 例，女 13 例，年龄 38～81 岁[平均（59.3±11.3）岁]；活动期病例14人，缓解期病例13人。

（2）PV患者亲属组：27名PV患者的一级亲属40例，其中男 16例，女 24例，年龄 14～69岁[平均（37.4±15.7）岁]，均无大疱性皮肤病及其它自身免疫性疾病史。

（3）正常对照组：本院健康献血者20例，其中男12 例，女 8 例，年龄 19～43 岁[平均（36.3±10.6）岁]。

1.2主要试剂 间接免疫荧光试剂盒购自德国欧蒙公司；膜蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司；二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG购自SBA生物公司；免疫电泳的相关试剂购自武汉博士得生物公司。

1.3实验方法 抽取外周静脉血5 mL，分离血清，将血清分成2份置-80℃冰箱冻存待用；一份做IIF，一份做 WB。

1.3.1血清中PV-Ab滴度检测 采用间接免疫荧光试剂盒，严格按试剂盒说明书操作。

1.3.2血清中IgG亚型与抗原分布

1.3.2.1分离表皮 取健康成人包皮，去除皮下组织，生理盐水反复冲洗，将组织剪成约0.3mm×0.3mm大小，置于0.25%胰蛋白酶中4℃孵育12 h，轻轻分离出表皮。

1.3.2.2膜蛋白提取 ①表皮冰上剪碎，置于玻璃匀浆器内，加1 mL裂解缓冲液匀浆。②匀浆液4℃、3 000 r/min离心10 min；取上清，4℃、14 000 r/min离心30 min；取沉淀加1 mL抽提缓冲液，涡旋振荡混匀；4℃、3 000 r/min离心5 min；取上清，37℃水浴10 min，室温下13 000 r/min离心5 min。③取下层有机相加入500 μL冷灭菌水，4℃放置5 min，37℃水浴10 min，室温下13 000 r/min离心5 min。同法再提取1次，最终得到的下层即为膜蛋白提取物。

1.3.2.3免疫印迹 主要步骤有①聚丙烯酰胺凝胶电泳（8%分离胶电泳）；②转膜；③封闭；④一抗（待测血清）孵育；⑤二抗(辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)孵育；⑥丽春红染色；⑦观察结果。具体操作步骤参考《免疫学常用实验方法》[4]。

1.4统计学方法 应用SPSS 17.0统计分析软件进行分析，阳性率比较用χ2检验，几何均数比较用t检验分析。

2 结果

2.1PV-Ab检测 荧光显微镜观察上皮细胞间有淡黄色荧光呈网状沉积为阳性。PV患者的PV-Ab阳性率明显高于一级亲属和正常对照（P<0.000 1，0.001），一级亲属PV-Ab阳性率也明显高于正常对照（P<0.01）；活动期与缓解期PV患者的PV-Ab滴度阳性率差异也有统计学意义（P<0.01），见表1。PV患者的平均 PV-Ab滴度（1∶2 030±369.3）明显高于一级亲属（1∶22.9 ± 34.0）（P<0.001），而活动期 PV 患者的平均 PV-Ab滴度（1∶2 793.1± 4 129.3）也明显高于缓解期患者（1∶46 ± 49.3）（P<0.01）。

表1 各组PV-Ab阳性率

2.2PV-IgG亚型与Dsg1、Dsg3的反应性 凝胶电泳提取的膜蛋白中有分子量各异的蛋白质，其中含有目的蛋白Dsg1和Dsg3，分子量分别为160 kD、130 kD，见图1。PV抗原、抗体免疫印迹图见图2。WB检测结果显示，在20例正常对照中，仅2例PV-IgG阳性（10%）；在27例PV患者中，25例PV-IgG阳性（92.6%）；在40例一级亲属中，17例PV-IgG阳性（42.5%）。PV患者及其一级亲属的PV-IgG阳性率明显高于正常对照，其中PV患者最高（P<0.000 1，0.001），但活动期与缓解期患者的PV-IgG阳性率差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

与一级亲属比较，PV患者中Dsg3反应性IgG4水平明显增加（P<0.01），且活动期病例的水平也明显高于缓解期者（P<0.05），见表3，但其余3种Dsg3反应性IgG亚型和4种Dsg1反应性IgG亚型水平在PV患者与一级亲属、活动期与缓解期病例之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组Dsg1、Dsg3反应性IgG检测结果

表3 Dsg3反应性IgG亚型检测结果

图1 凝胶电泳结果图

图2 PV抗原、抗体免疫印迹图

3 讨论

3.1PV患者和一级亲属中PV-Ab 国外报道PV患者PV-Ab阳性率很高，尤其是活动期PV患者，阳性率高达95%[5]。国内学者用IIF检测了PV活动期患者，发现PV-Ab阳性率为93.2%。自从在PV患者的一级亲属中发现PV-Ab以来，国外研究发现PV患者的一级亲属中PV-Ab阳性率一般为45%～60%[6]。国内耿龙等[7]研究了东北地区12例PV患者的30例一级亲属，检出PV-Ab阳性19例（63%）。我们应用IIF研究发现，湛江地区活动期PV患者及其一级亲属中血清PV-Ab阳性率分别为92.9%、17.5%，正常对照者则无PV-Ab。对PV患者一级亲属的研究结果明显低于国外及耿龙等的报道，其原因可能有三：一是检测方法和底物不同；二是样本量存在差异；三是不同地区人群有种族差异。

虽然PV患者的一级亲属中PV-Ab检出率明显增加，但一级亲属很少发病。Beutner等[8]收集了234例天疱疮病例，发现仅有一例家族性发病。Kavala等[5]研究认为一级亲属中存在PV-Ab，只能说明天疱疮与遗传因素有关，但遗传因素不是天疱疮发病的必需条件，由于PV患者的亲属血清中PV-Ab滴度很低，不足以与天疱疮抗原结合而引起临床表现。因此认为一级亲属是PV-IgG的携带者，本身不发病。我们发现PV患者中PV-Ab滴度在1∶10～1∶10 000 之间（平均滴度为 1∶2 030 ± 369.3），而一级亲属中 PV-Ab滴度在 1∶10～1∶100之间（平均滴度为1∶22.9±34.0），二者之间的差异有统计学意义，说明PV-Ab滴度可能是影响患者发病的重要因素。

3.2PV患者和一级亲属中IgG亚型及其与Dsg反应性 天疱疮抗体为抗Dsg的自身IgG抗体，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四个亚型。一般认为不同类型天疱疮中存在不同抗体亚型，但不同亚型天疱疮抗体如何引起棘层松解仍未完全阐明。Brooks等[9]发现PV患者血清中以IgG1为主，而Jones等[10]却在PV患者中检测到高滴度IgG4。Bhol等用WB发现在活动期PV患者血清中，几乎均有IgG1和IgG4，而在缓解期患者、一级亲属及正常对照中只有IgG1，认为PV-IgG4是引起棘层松解的主要致病抗体[2]。

目前的研究证实IgG4可导致PV和PF患者棘层松解，但IgG1的致病作用仍未肯定。Torzecka等[11]发现在活动期PV患者中，血清IgG1和IgG4明显高于缓解期患者和一级亲属。Amagai等[12]的研究表明，活动期PV患者血清中存在抗Dsg1和Dsg3的IgG1、IgG4；疾病缓解时抗Dsg3抗体转为阴性，但抗Dsg1抗体仍呈阳性。

本研究结果显示，PV患者的IgG均与Dsg3反应，其中64%IgG也可与Dsg1结合；PV患者中Dsg3反应性IgG4水平明显高于其一级亲属，且其在活动期病例中含量也高于缓解期，但其余IgG亚型在两组之间差异无统计学意义。这些结果提示IgG4是本病的致病抗体，Dsg3是主要抗原；IgG1、IgG2、IgG3在PV发病过程中可能不起主要作用，Dsg1不是PV的主要抗原。

综上所述，在PV患者中，PV-AB滴度与病情呈正相关，IgG4是主要致病抗体，Dsg3是主要抗原。只有当IgG4与Dsg3结合时，患者才会出临床表现。当患者病情缓解时，PV-Ab滴度下降。由于PV患者的一级亲属中PV-Ab滴度较低，且以非致病性IgG2和IgG3为主，故他们很少发病。通过检测PV患者PV-Ab滴度和IgG亚型，不仅有助于进一步阐明本病的发病机制，而且可为本病的诊断和疗效观察提供理论依据。

［1]Torzecka JD,Narbutt J,Sysa-Jedrzejowska A,et al.Detection of pemphigus autoantibodies by IIF and ELISA tests in patients with pemphigus vulgaris and foliaceus and in healthy relatives[J].Med Sci Monit,2003,9:CR528-533.

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［4]朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，2000:86-87.

［5]Kavala M,Kocaturk OE,Demirkesen C,et al.Detection of pemphigus autoantibodies in healthy relatives of Turkish patients with pemphigus[J].Indian J Dermatol Venereol Leprol,2007,73:240-242.

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