抗氧化肽对人肺癌细胞 A549,红细胞和肝组织氧化性损伤的抑制作用

刘志东,郭本恒,王荫榆*,李云飞,刘振民,王建飞

1上海交通大学 生命科学技术学院,上海 200240;2光明乳业技术中心,乳业生物技术国家重点实验室上海 200436;3上海交通大学农业与生物学院,上海 200240

正常情况下,机体内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)等的产生与清除处于动态平衡状态。但当机体受到某些异常的理化因素刺激或处于病理状态时,可产生大量的 ROS,致使机体的氧化还原平衡遭到破坏,过量的 ROS可引起脂质过氧化,DNA和蛋白质损伤与多种慢性疾病如癌症、衰老、动脉粥样硬化及神经系统的疾病[1]。抗氧化剂能够拮抗体内过量的自由基,阻止 ROS诱导的细胞损伤,避免组织受到氧化伤害,从而预防相关疾病的发生[2,3]。由于红细胞膜富含大量多不饱和脂肪酸,因而易受活性氧自由基(ROS)等的攻击而发生过氧化反应,引起红细胞结构和功能的改变,如MDA的生成,膜脆性的增加,膜内外离子浓度的电化学梯度丧失等,最终导致红细胞溶血的发生。所以,红细胞常作为氧化应激的模型来评估未知物的抗氧化活力。

由于各种体系之间差别较大,其抗氧化活性也可能有所不同,所以有必要研究不同的生物体系之间是否也存在相同的抗氧化效果。本文研究了抗氧化肽 A对人肺癌细胞 A549,红细胞氧化性溶血和肝组织匀浆氧化性损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

抗氧化肽 A,根据本实验室发现的乳抗氧化肽合成(纯度≥95%);人肺癌细胞 A549,国家新药筛选中心;Wistar大鼠,上海斯莱克实验动物有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 抗氧化肽 A对人肺癌细胞 A 549的影响

采用 MTT法测定抗氧化肽对人肺癌细胞 A549的抑制作用[4]。取对数生长期的肿瘤细胞,用0.25%胰酶消化后,加入 96孔细胞培养板(每孔含细胞约 1×105个),80μL/孔,置于 37℃,5%CO2恒温恒湿培养箱中培养,癌细胞为贴壁生长。培养48 h后 ,每孔内分别加入 0.016、0.063、0.250、1.000、4.000mM的抗氧化肽 10 μL/孔;不加样品的细胞培养液为对照组,每组设 3个复孔。每孔加入 5 mg/mL的 MTT溶液 10μL培养 4 h。然后吸去上清,每孔加入 100μL的 DMSO,轻轻震荡 10 min,在 570 nm波长处用酶标仪测定各孔的吸收值,取平均值计算抑制率。

细胞抑制率 =(OD对照组 -OD剂量组)/对照组 OD×100%(1)

1.2.2 大鼠红细胞悬浮液的制备及氧化性溶血抑制率的测定

Wistar大鼠用 10%乌拉坦腹腔注射麻醉、自颈动脉取血。用 3%枸橼酸钠抗凝,0.9%NaCl稀释,3000×g,0℃离心 10 min分离得到红细胞,灭菌生理盐水洗涤三次后,以生理盐水配成 0.5%的悬浮液。取红细胞悬浮液 5mL与 0.2mL不同浓度的样品混合,于 37℃温育 24 h(对照管以蒸馏水代替样品液)。然后以生理盐水稀释 5倍,1000×g离心 10 min取上清液,于 540 nm处比色,根据吸光度计算抑制率[5]。公式如下:

溶血抑制率(%)=(1-样品管吸光度/对照管吸光度)×100%(2)

1.2.3 大鼠肝组织匀浆丙二醛(MDA)生成的影响

取小鼠肝组织 1.0 g,用冰冷的生理盐水漂洗后,滤纸吸干,称重。置于 5 mL小烧杯中,量取 9倍于体积块体积的生理盐水,将 2/3的生理盐水倒入烧杯中,以眼科剪迅速剪碎组织块,再将剪碎的组织连同生理盐水一起倒入玻璃匀浆器中,然后用剩余的生理盐水冲洗烧杯和眼科剪,并倒入匀浆器,匀浆6～8 min,使组织匀浆化,整个过程应置于冰浴中完成。匀浆完全后将匀浆液以 3000～4000 r/min离心10～15min,上清液即为肝组织匀浆液。

于试管中加入 10%的小鼠肝组织匀浆液 0.20 mL及不同浓度的样品 0.10m L,对照加等体积生理盐水。37℃温育 1 h后取出,冰浴冷却,按MDA测定试剂盒中方法操作,由于 MDA与硫代巴比妥酸缩合形成的红色产物在 532 nm处有最大吸收,因此在该波长下测定吸光度,计算其 MDA含量。公式如下,其中匀浆液蛋白含量测定以牛血清白蛋白为标准,采用 Lowry法[6]。

组织中 MDA含量 =(OD实验管 -OD空白管)×标准浓度 ÷蛋白含量 (3)

另取两组试管,一组先加入 10mmol/L的 H2O20.10 mL,另一组先加入 lmM的 FeSO40.10mL,然后再按前述方法,向这两组试管加入组织匀浆和样品液,温育,冷却,测定 MDA的含量[7]。

1.3 数据处理

数据采用 SPSS 11.5统计软件进行处理,结果以 x±s表示。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化肽 A对人肺癌 A549细胞生长的影响

表 1 抗氧化肽对A549细胞生长的影响(n=3)Table 1 Effect of the antioxidant peptide on the growth of A549 cell(n=3)

细胞的持续分裂和增殖是癌细胞的一个重要特征。因此考察对肿瘤细胞增殖的抑制作用是鉴定外源性物质抗肿瘤作用的一个基本指标。研究表明生物活性肽对非内分泌性实体肿瘤如肝癌、肺癌[8-10]的生长具有抑制作用,其抗肿瘤效应和抗氧化效应逐渐为人们所认识。K.D.Kent等[11]研究了乳清分离蛋白(WPI)酶解物对细胞内谷胱甘肽和人前列腺上皮细胞氧化致死的影响。结果表明 WPI酶解物能促进细胞内谷胱甘肽的合成并保护因氧化引起的人前列腺上皮细胞的死亡。肺癌是最常见的呼吸道恶性肿瘤之一,人肺癌 A549细胞是具有旺盛的增殖能力的低分化肺癌细胞株。因此,本实验采用人肺癌 A 549细胞为靶细胞探讨抗氧化肽 A对 A549的抑制作用。实验结果表明,不同浓度的抗氧化肽A对 A549细胞生长均有抑制作用;1.00 mg/m L的抗氧化肽作用于 A549细胞后,其抑制率可达81.66%。结合国内外相关的研究,我们认为抗氧化肽对肿瘤的抑制机制可能是通过受体介导和非受体介导途径两种途径[12-15]。但具体是以哪种途径为主或两种途径如何相互作用还有待进行深入的研究。

2.2 抗氧化肽 A对大鼠红细胞氧化性溶血的影响

机体内的红细胞具有运输 O2及 CO2的作用,其膜内的血红蛋白使其功能的发挥成为可能。但如果红细胞膜被破坏,其内部的血红蛋白外溢,红细胞的转运功能便丧失。红细胞不仅在体内每天都有一部分发生自身氧化解体,而且在体外温育条件下也可产生氧化溶血反应。当红细胞受到自由基等的攻击时,容易发生脂质过氧化反应并发生红细胞溶血现象。血红细胞发生溶血的原因可能是由于:(1)红细胞发生过氧化反应时,当红细胞内的内源性抗氧化剂被消耗后,红细胞膜就会发生脂质过氧化反应并引起红细胞膜通透性和脆性的增加,膜的流动性降低、变形能力下降,最终导致红细胞的形态发生肿胀、变形;(2)随着 MDA生成量的增加,红细胞膜蛋白发生氧化交联或降解,红细胞膜的骨架发生破坏,最终导致溶血现象的发生。因此,红细胞溶血反应的发生很可能是脂质过氧化和红细胞膜蛋白降解的结果。但是,内源性抗氧化剂的消耗,脂质过氧化,或膜蛋白质的降解都不能清楚地解释过氧自由基诱导红细胞溶血的机制。到目前为止,有关自由基诱导红细胞溶血的机制还不是完全清楚。但可以肯定的是,脂质过氧化是红细胞发生氧化性损伤过程中的一个主要结果,常被认为是导致红细胞伤害和死亡(如溶血)的一个主要机制[16]。红细胞是常用的分析和筛选天然抗氧化剂的实验体系,考察对红细胞膜结构和功能上的影响是迄今被公认的研究细胞氧化损伤的重要方法之一。张强等[17]研究发现玉米抗氧化肽对 H2O2诱导的红细胞氧化溶血具有较好的抑制作用 (P＜0.01),并且表现出一定的量效关系。Jesus N.S.等[18]采用人血红细胞研究了四种亚马逊植物多酚的抗溶血作用。

本研究探讨了抗氧化肽对由大鼠红细胞氧化性溶血的影响,结果见表 2,不同浓度的抗氧化肽对大鼠红细胞氧化性溶血具有一定的抑制作用,即随着抗氧化肽浓度的增加,抗氧化肽对大鼠红细胞氧化性溶血抑制率也逐渐增加,其中在 1.25和 2.50 mg/m L浓度下的作用效果较为显著(P＜0.05)。这表明抗氧化肽能够抑制大鼠红细胞氧化性溶血现象的发生,有效地保护红细胞结构的完整性。

表 2 抗氧化肽对大鼠红细胞氧化性溶血的影响(n=3)Table 2 Effect of the antioxidant peptide on the hemolysis ofm ice RBC(n=3)

2.3 抗氧化肽 A对小鼠肝组织匀浆MDA生成的影响

机体产生的氧自由基能够攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引起脂质过氧化反应,形成 MDA等脂质过氧化物。脂质过氧化反应不仅能够把活性氧转化成非自由基性的脂类分解产物,而且还能够通过链式支链反应放大活性氧的作用。此外,氧自由基不但能通过生物膜上多不饱和脂肪酸的过氧化反应来损伤细胞,而且还能通过氢过氧化物分解的产物引起细胞损伤。由于 MDA是脂质过氧化反应的产物,故其含量可以用于评价脂质过氧化反应的程度。张强等[17]研究发现玉米抗氧化肽对 Cys-Fe2+诱导的肝脏、心脏、脑组织脂质过氧化也具有较好的抑制作用 (P＜0.01),表明它可以有效地减弱体外的脂质过氧化反应,但其确切的作用机制目前还少有报道。

表 3 抗氧化肽对小鼠肝组织匀浆 MDA生成的影响(n=3)Table 3 Effect of the antioxidant peptide on MDA formation ofmice liver(n=3)

严奉伟等[19]研究发现菜籽多酚能降低小鼠肝 组织匀浆的 MDA(P＜0.01),减少小鼠体内脂质过氧化产物等自由基的产生。在温育条件下,肝组织匀浆在活性氧(ROS)或促氧化的金属离子作用下,其中的不饱和脂质会发生过氧化反应。不同浓度的抗氧化肽在实验浓度范围内对小鼠肝组织匀浆MDA形成的抑制作用如表 3所示,从表中可以看出肝组织匀浆 MDA形成的抑制率随着抗氧化肽浓度的增加而增大,其最高抑制率可以达到 57.91%。Fe2+和 H2O2是很强的自由基诱导物,在体系中添加它们后,小鼠肝组织匀浆中自氧化产生的 MDA明显增加。抗氧化肽能够较好地抑制 H2O2诱导的 MDA的产生,而对 Fe2+诱导的体系则不是很明显,具体原因还有待进一步分析。这表明抗氧化肽能够通过清除自由基,抑制肝组织匀浆的脂质过氧化反应,稳定肝细胞膜的结构而对肝组织起到保护作用。

3 结论

3.1 抗氧化肽 A在一定浓度范围内对人肺癌细胞A549的生长具有抑制作用。

3.2 抗氧化肽 A对大鼠红细胞氧化性溶血抑制率具有剂量依赖性,其中在 1.25和 2.50mg/m L浓度下的作用效果较为显著(P＜0.05)。

3.3 抗氧化肽 A可以抑制小鼠肝组织匀浆 MDA的生成,抑制率随着浓度的增加而增加,尤其对体外温育和 H2O2诱导的小鼠肝组织匀浆 MDA的生成具有较强的抑制作用。

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