三种倍半萜类化合物体外抗肿瘤细胞增殖活性研究

于 峰,王思明,董 玫,倪志宇,董富洁,史清文*,铃木信夫,丛 斌

1河北医科大学法医学系河北省法医学重点实验室,石家庄 050017;2河北医科大学药学院,石家庄 050017;3千叶大学医学部环境影响生物化学教室,千叶市

菊科是有花植物中最大的科,含有 1100多个属,23000～25000多种植物,很多菊科植物在各国民间药用。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花属植物,为多年生草本,其根供药用,具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效[1]。性温,味辛、苦。在我国分布于新疆,其它许多地区常栽培。药理活性研究发现土木香内酯类成分有抗肿瘤细胞增殖作用和抗结核分支杆菌等作用[2,3]。旋覆花(Inula japonica)为菊科旋覆花属植物,是多年生直立草本植物,主要分布于我国的东北、华北、西北及浙江、江苏、四川和广东等地区[1]。近年研究表明旋覆花的主要成分为倍半萜内酯类化合物,药理活性方面有细胞毒性和抗微生物等报道[4,5]。本文对从土木香的根中和旋覆花得花中分离得到的三种主要倍半萜内酯化合物异土木香内酯(1)[6],1-氧-乙酰大花旋覆花内酯(2)[7]和大花旋覆花内酯(3)[7]进行了体外抗肿瘤细胞增殖活性的实验,初步探讨了这三种化合物结构与活性之间的构效关系。

1 材料与方法

1.1 试验药物

三种倍半萜类化合物:异土木香内酯(1),1-氧-乙酰大花旋覆花内酯(2)和大花旋覆花内酯(3)由史清文教授分别从菊科旋覆花属土木香(Inula helenium)的根中和旋覆花(Inula japonica)的花中分离得到,均为白色针晶,经核磁共振光谱和质谱确定它们的结构如下(1～3),纯度 99%。

1.2 药品和试剂

噻唑蓝(MTT,Sigma,M-2128);RPMI 1640培养基(GIBCO);胰蛋白酶(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);顺铂(Sigma,034k3693)。

1.3 细胞系和培养条件

试验用肿瘤细胞株由日本千叶大学医学部第二生物化学教室提供。U251SP:人脑神经胶质瘤细胞株[8];HLE:人肝癌细胞株[8];MM1-CB:人黑色素瘤细胞株[8];KT:人乳腺癌脑转移肿瘤细胞株[8]。试验用正常细胞由河北医科大学基础医学院细胞生物学实验室提供。HELF:正常人胚肺成纤维细胞。各肿瘤细胞株接种于直径为 100mm的培养皿中,加入含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基,37℃和5%CO2培养箱中培养。

1.4 方法

参照文献[9]中的方法。将被试细胞悬浮接种于 96孔板,每孔 90μL(含 1×104个细胞),分别加入磷酸盐缓冲液(PBS)、溶剂对照(终浓度 0.5%DMSO)、阳性对照顺铂和终浓度为 100、10和 1 μmol/L的化合物 1～3各 10μL,每组均设 3复孔,置于饱和湿度、37℃和 5%CO2培养箱中培养 72 h。于培养结束前 4 h,各培养孔加入 5mg/mL四氮唑盐 (MTT)10μL,用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值),测定波长 λ=570 nm,参考波长 λ=630 nm,并计算细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率(%)=(1-OD对照组/OD实验组)×100%。

1.5 统计学处理

数据用 x±s表示;两组间数据用 t-检验,多组间数据用单因素方差分析。应用 SAS612统计软件计算。

2 结果

2.1 化合物 1～3对体外培养的 U251SP细胞增殖的抑制作用

结果如图 1所示,阳性对照顺铂显示较强的抑制人脑神经胶质瘤细胞(U251SP)增殖活性的作用,1、10和 100μmol/L顺铂处理 U251SP细胞后,肿瘤细胞抑制率分别为 24.62、47.71和 69.99;化合物 1用相同的剂量处理 U251SP细胞后,其肿瘤细胞增殖抑制率与顺铂几乎相同,分别为 21.48、54.56和72.20,并且与空白对照组相比较极显著性差异,提示化合物 1有较强的抑制 U251SP细胞增殖的作用。通过肿瘤细胞增殖抑制率对顺铂和化合物 1浓度的对数回归方程 y=9.8521lnx+24.755和 y=11.014lnx+24.053,得到顺铂和化合物 1对U251SP细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为12.97和 10.55μmol/L。化合物 2和 3对 U251SP细胞的增殖不显示抑制活性。

图 1 三种倍半萜内酯化合物对人脑神经胶质瘤细胞增殖的影响Fig.1 Effect of three compounds on the proliferation of U251SP tumor cell line

2.2 化合物 1～3对体外培养的人肝癌细胞增殖的抑制作用

结果如图 2所示,阳性对照顺铂对人肝癌细胞(HLE)增殖几乎不显示抑制活性,即使用 100 μmol/L顺铂处理 HLE细胞,其肿瘤细胞抑制率仅为 14.01%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1处理 HLE细胞后,其肿瘤细胞抑制率分别为 21.42、36.56和 64.13,与空白对照组相比较极显著性差异,并且呈现较好的剂量以来关系,提示化合物 1有较强的抑制 HLE细胞增殖的作用。化合物 2只在100μmol/L剂量组显示较强的肿瘤细胞增殖抑制活性,其肿瘤细胞增殖的抑制率为 55.67,而化合物3对 HLE细胞的增殖不显示抑制活性。

图 2 三种倍半萜内酯化合物对人肝癌细胞增殖的影响Fig.2 Effect of three compounds on the proliferation of HLE tumor cell line

2.3 化合物 1～3对体外培养的人黑色素瘤细胞增殖的抑制作用

结果如图 3所示,阳性对照顺铂对人黑色素瘤细胞(MM 1-CB)增殖几乎不显示抑制活性,即使用100μmol/L顺铂处理 MM 1-CB细胞,其肿瘤细胞抑制率仅为 8.98%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1处理 MM1-CB细胞,其肿瘤细胞增殖抑制率分别为 13.77、61.44和 87.03,与空白对照组相比较极显著性差异,并且呈现较好的剂量以来关系,提示化合物 1有较强的抑制 MM1-CB细胞增殖的作用。化合物 2只在 100μmol/L剂量组显示中等程度的肿瘤细胞增殖抑制活性,其肿瘤细胞增殖抑制率为39.13,而化合物 3对 MM1-CB细胞的增殖不显示抑制活性。

图 3 三种倍半萜内酯化合物对人黑色素瘤细胞增殖的影响Fig.3 Effectof three compounds on the proliferation of MM 1-CB tumor cell line

2.4 化合物 1～3对人乳腺癌脑转移肿瘤细胞增殖抑制活性的影响

阳性对照顺铂对人乳腺癌脑转移肿瘤细胞(KT)的增殖显示较强的抑制活性,IC50仅为 6.26 μmol/L,而化合物 1对 KT细胞的增殖显示中等程度的抑制活性,IC50为 48.52μmol/L,化合物 2和 3对 KT细胞增殖不显示抑制活性,IC50均大于 100 μmol/L。

2.5 化合物 1～3对人胚肺成纤维细胞增殖抑制活性的影响

实验结果如图 4所示,阳性对照顺铂对人胚肺成纤维细胞(HELF)的增殖呈现较强的抑制活性,IC50为 16.89μmol/L,化合物 1仅在 100μmol/L剂量组显示较低的细胞增殖抑制活性,其细胞增殖抑制率为 22.54,其它两种试验用化合物对 HELF细胞的增殖不显示抑制活性,三种被试化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

图 4 三种倍半萜内酯化合物对人胚肺成纤维细胞增殖的影响Fig.4 Effect of three compounds on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3 讨论

癌症是威胁人类健康的一大凶手,是仅次于心脑血管疾病的第二大致死性疾病(如果将心血管疾病和脑血管疾病分开统计,癌症则位于第一位),严重地威胁人类的健康和生命。现在临床上应用的抗癌药物虽然种类不少,但价格昂贵,毒副作用严重,且尚没有治疗某些癌症的特效药。因此寻找疗效确切,作用机理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌药物,攻克癌症成为全世界医药工作者亟待解决的一大课题。植物在其漫长的进化过程中合成了许许多多结构各异的次生代谢天然产物,这些次生代谢产物不仅具有不同的生物活性,还常常被发现有新的作用机制,象紫杉醇(Taxol·)、长春新碱(Vincristine,VCR)、喜树碱(Camptothecin,CPT)就是从植物中发现的三个优秀的天然抗癌药物中的代表,但彼此具有三个不同的甚至完全相反的抗癌作用机制,这些天然药物的发现和在临床上的广泛应用,极大地推动了化学家和药学家对抗癌药物的研发,并极大地促进了病理学家和生物学家对抗癌作用机理的研究[10,11]。据统计,目前使用的化学药物中,30%以上是天然化合物经结构修饰产生的,而临床上应用的抗癌药物 74%来源于天然产物和天然产物的衍生物或是因受天然产物结构的启发而设计的合成药物。从包括植物在内的自然界中寻找发现高效低毒的抗癌活性成分或先导化合物一直是国内外药物学家十分关注的课题和研究的热点[12-29]。用中草药治疗癌症在我国有着悠久的历史和丰富的临床经验,用现代的方法研究其活性成分及其作用机制是发现新的先导化合物研制开发新型抗癌药物的一条捷径。

菊科旋覆花属植物含有丰富的倍半萜内酯类化合物,很多倍半萜内酯类化合物都显示有不同程度的抗肿瘤活性。杨超等于 2003年报道了旋覆花地上部分的倍半萜内酯类成分对肿瘤细胞 SMMC-7721以及 HO-8910具有细胞毒作用[4]。

本实验研究结果显示,三个倍半萜内酯类化合物中,异土木香内酯对人脑神经胶质瘤细胞、肝癌细胞、人黑色素瘤和人乳腺癌脑转移肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用,对于正常的细胞,即人胚肺成纤维细胞的增殖不呈现抑制活性,而 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯仅在 100μmol/L的高浓度下,对人肝癌细胞和人黑色素瘤细胞的增殖显示中等程度的抑制活性,大花旋覆花内酯对人脑神经胶质瘤细胞、肝癌细胞、人黑色素瘤和人乳腺癌脑转移肿瘤细胞的增殖不显示任何抑制活性。从结构上分析异土木香内酯(1)属于桉叶烷型(Eudesmane)倍半萜内酯,A环和 B环呈反式聚合,7,8位含有一个 α,β-不饱和的五员内酯环。1-氧-乙酰大花旋覆花内酯(2)和大花旋覆花内酯(3)都属于 1,10-开环的桉叶烷型(1,10-Seco-eudesmane)倍半萜内酯,二者在 5位均有一个含有 5个碳原子的侧链,由此推测 A环开环可能是导致 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯(2)和大花旋覆花内酯(3)对人脑神经胶质瘤细胞、肝癌细胞、人黑色素瘤和人乳腺癌脑转移肿瘤细胞的增殖不显示抑制活性的原因。

1 Delectis Florae Repub licae Popu laris Sinicae Agendae Academiae Sinicae.Flora Republicae Popularis Sinicae.Beijing:Science Press,1979,75:248-254.

2 Cantrell CL,Abate L,Fronczek FR,et al.Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia subtomentosa.Planta Med,1999,65:351-355.

3 Konishi T,Shimada Y,Nagao T,et al.Antiproliferative sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium.Biol Pharm Bull,2002,25:1370-1372.

4 Yang C,Wang CM,Jia ZJ.Sesquiterpenes and other constituents from the aerial parts of Inula japonica.Planta Med,2003,69:662-666.

5 Chinese Academy of Medicine.Instituent of Pharm cy.Beijing:Traditional Chinese Medicine People's Health Press,1984,3:476-484.

6 Bohlmann F,Mahanta PK,Jakupovic J,etal.Phytochemistry,1978,17:1165-1167.

7 Jeske F,Huneck S,Jakupovic J.Secoeudesmanolides from Inu la japonica.Phytochemistry,1993,34:1647-1649.

8 Susuki N,et al.Dipyridamole combined with tumor necrosis factor-a enhances inhibition of proliferation in human tumor cell lines.Jpn JCancer Res,1995,86:761-769.

9 Situ ZQ(司徒镇强).Cell Culture(细胞培养).Beijing:World Book Publishing,1996.134-138.

10 Schiff PB,Fan J,Horwitz SB.Promotion ofm icrotubule assembly in vitro by taxol.Nature,1979,277:665-667.

11 Schiff PB,Horwitz SB.Taxol stabilizesmicrotubules inmouse fibroblast cells.Proc Natl Acad Sci USA,1980,77:1561-1565.

12 Newman DJ,Gragg GM,Snader KM.Natural p roducts as sources of new d rugs over the periods 1981-2002.J Nat Prod,2003,66:1022-1037.

13 Sak lani A,Kutty SK.Plant-derived compounds in clinical trials.Drug Discovery Today,2008,13:161-171.

14 Lee KH.Current developments in the discovery and design of new drug candidates from p lant natural product leads.J Nat Prod,2004,67:273-283.

15 Simmonds MSJ.Novel d rug from botanical source.Drug Discovery Today,2003,8:721-722.

16 Altmann KH,Gertsch J.Anticancer drugs from nature-natural p roducts as a unique source of newm icrotubule-stabilizing agents.Nat Prod Rep,2007,24:327-357.

17 Butler MS.The role of natural product chemistry in drug discovery.JNat Prod,2004,67:2141-2153.

18 John Boik(Ed).NaturalCompounds in Cancer Therapy.Oregon Medical Press,LLC,Minnesota,USA,2001.

19 Butler MS.Natural products to d rugs:natural p roduct derived compounds in clinical trials.Nat Prod Rep,2005,22:162-195.

20 Chin YW,Balunas MJ,Chai HB,et al.Drug discovery from natural sources.AAPSJ,2006,8:E239-E 253.