白芷中四种线型呋喃香豆素类成分药理作用研究

王梦月,贾敏如,马逾英,李晓波

1成都中医药大学药学院,成都 610075;2上海交通大学药学院,上海 200240

白芷为一常用中药,用于鼻渊头痛、风湿痹痛等病的治疗,疗效确切。白芷的主要化学成分为香豆素,我们前期研究首次发现白芷总香豆素具有明显的镇痛和解痉作用,能明显对抗热板、冰醋酸所致小鼠疼痛及 BaCl2所致兔肠平滑肌痉挛[1];秦旭华、Okuyama T等也报道白芷总香豆素具有明显的镇痛作用[2]、抗肿瘤作用[3]。但白芷镇痛、解痉、抗肿瘤的活性成分尚不清楚。白芷的主要香豆素类成分为异欧前胡素(isoimperatorin,1)、欧前胡素(imperatorin,2)、白当归素(byakangelicin,3)、水合氧化前胡素(oxypeucedanin hydrate,4)等线型呋喃香豆素[4](图1)。为进一步探讨白芷镇痛、解痉、抗肿瘤的活性成分,从而为白芷的质量控制提供科学依据,我们对上述 4种呋喃香豆素进行了镇痛、解痉、抗肿瘤实验,本文报道研究结果。

图 1 4种呋喃香豆素结构式Fig.1 The structure of four furocourmarins

1 实验材料

1.1 实验药材

2002年 7月采于四川省遂宁市川白芷 GAP基地,经成都中医药大学药学院贾敏如教授鉴定为杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,凭证标本保存于成都中医药大学药学院。根晒干备用。

1.2 细胞株

1.3 实验动物

昆明种小鼠:清洁级,体重 20±2 g,由成都中医药大学医学实验动物中心提供[动物合格证:川实动管 2003(6)号];新西兰兔:清洁级,体重 2.0～2.5 kg,由中国医学科学院输血研究所提供(动物合格证:川实动管 99-11号)。

1.4 药物、试剂及耗材

硫酸罗通定注射液(广东博罗先锋药业集团有限公司,批号:020408,使用前用生理盐水配成 4 mg/mL备用),二甲基亚砜(DMSO,常州市科丰化学试剂厂),3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT,美国 AMRECO公司),RPMI1640培养基(美国 GibicoBRL公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),乙酰胆碱(广州化学试剂公司),氯化钡(Sigma公司),台氏液(新鲜配制)。其余化学试剂均为分析纯。

1.5 主要仪器

SW-CJ-1C超净工作台(苏州仪器厂),BL-410生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司),YLS-6A智能热板仪(山东省医学科学研究院设备站),5701水套式 CO2培养箱(美国 Thermo Forma公司),ELX800酶标仪(美国 Bio-Tek公司)。

2 实验方法

2.1 统计学处理

应用 SPSS 11.5进行 One-Way ANOVA检验及IC50的计算。

2.2 药理供试样品的制备

杭白芷根 30 kg,粉碎成粗粉,150 L乙醇回流提取 3次,回收乙醇得醇浸膏 1334 g。醇浸膏悬浮于水,石油醚(30～60℃)萃取,弃去石油醚部分;继续以醋酸乙酯萃取,回收溶剂得总香豆素 477 g。取总香豆素 200 g,行硅胶柱层析,石油醚洗脱,弃去洗脱流份 ;继用石油醚-醋酸乙酯 (95:5、80:20、60:40、40:60)洗脱,分别得异欧前胡素 1250mg、欧前胡素2345 mg、白当归素 1850 mg、水合氧化前胡素 3680 mg。上述成分均经1H NMR、13C NMR、EI-MS等方法确定结构。

4种香豆素均加入 1%的吐温-80生理盐水溶液,超声溶解,配成 0.5%的溶液供镇痛、解痉实验;用 DMSO配制成所 40、10、2.5、0.625、0.156 μg/mL供抗肿瘤实验。

2.3 镇痛实验

2.3.1 醋酸扭体法

排除标准：(1)术前检查发现内科疾病者；(2)对镇痛类药物过敏者；(3)发现腕管内肿瘤压迫者或伴有术前急慢性感染者。

100只小鼠(雌雄各半),随机分为 10组,每组10只。阴性对照组腹腔注射 10 g/kg(体重)的 1%吐温 80生理盐水溶液,其余组按表 1剂量腹腔注射给药。30min后腹腔注射 0.6%醋酸溶液 0.2mL/只。观察并记录注射醋酸溶液后的扭体潜伏期及20min内出现扭体反应的次数。实验完毕,按下式计算药物镇痛百分率:镇痛率 =(对照组扭体次数-给药组扭体次数)/对照组扭体次数 ×100%[5]。

2.3.2 热板法

选择对 50℃热板痛觉反应在 10～30 s的小鼠100只,随机分为 10组,每组 10只。按表 2剂量腹腔注射给药(阴性对照给予 1%吐温 80生理盐水溶液),给药前及给药后 15,30,60,90 min测定痛反应潜伏期,按下式计算痛阈提高百分率:痛阈提高百分率 =(给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值)/给药前平均痛阈值 ×100%[5]。

2.4 解痉实验

取兔回肠一段,置盛有冷台氏液的平皿中,分离肠系膜,用台氏液冲洗干净,将肠管剪成长 2～2.5 cm小段。小段肠管两端穿线结扎,一端系于通气钩上,放入恒温台氏液中,另一端连接 BL-410生物机能实验系统。调节台氏浴槽内肠肌张力,观察正常肠肌活动。待自主活动稳定后,记录一段正常舒缩曲线,然后每段肠管按 A、B、C、D顺序进行实验。每次加药液前均用台氏液冲洗肠肌 3次,待舒缩恢复至用药前水平后再加下组试验药液,记录舒缩活动曲线[6]。

A:加入 0.5%异欧前胡素生理盐水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 m L,观察并记录舒缩曲线。观察后用台氏液冲洗。

B:加入 100μg/mL的乙酰胆碱液 0.4m L,当肠肌收缩显著时加入 0.5%异欧前胡素生理盐水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L。观察后用台氏液冲洗。

C:加入 100mg/mL的氯化钡液 0.2mL,待收缩显著时加入 0.5%异欧前胡素生理盐水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L。

D:换肠管,分别取欧前胡素、白当归素、水合氧化前胡素按上述顺序进行实验。

2.5 抗肿瘤实验

取对数生长期细胞消化,计数,5 000个每孔铺于 96孔板,在 37℃、含 5%CO2的培养箱培养 24 h后,加入药物(DMSO溶解),每个药物浓度设 3个平行孔,连续培养 48 h后,每孔加入 20μL 5 g/L的MTT,继续培养 4 h,贴壁细胞倾去培养基后每孔加入 150μL DMSO,轻轻震摇;悬浮细胞每孔加入 50 μL的三联液(10%SDS-5%异丁醇-0.1%盐酸),37℃培养箱中过夜。用酶标仪检测各孔 570 nm吸光度(A)值,并按下式计算抑制率:抑制率 =(对照组A值-实验组 A值)/对照组 A值 ×100%[7]。

3 实验结果

3.1 镇痛实验

3.1.1 醋酸扭体法

结果见表 1。四种香豆素均显著减少醋酸所致小鼠的扭体次数。异欧前胡素、欧前胡素还能明显延迟小鼠扭体的出现,而水合氧化前胡素、白当归素则无明显作用。4种呋喃香豆素类成分中欧前胡素的作用最强,75mg/kg的镇痛强度超过 40mg/kg的颅痛定。

表 1 四种呋喃香豆素对醋酸所致小鼠疼痛的影响Table 1 Effect on rats'pain caused by acetic acid

3.1.2 热板法

结果见表 2。异欧前胡素及欧前胡素均有显著的镇痛作用,能明显抑制热板法所致小鼠疼痛,欧前胡素的作用明显强于异欧前胡素。白当归素、水合氧化前胡素无明显作用。

表 2 四种呋喃香豆素对热板致小鼠疼痛反应的影响Table 2 Effect on rats'pain caused by hot board

注:与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。Note:*P＜0.05,**P＜0.01 vs NSgroup.

3.2 解痉实验

结果:4种香豆素对正常兔肠平滑肌舒缩均无明显影响;均不能显著缓解乙酰胆碱引起的兔肠平滑肌痉挛;异欧前胡素、欧前胡素、水合氧化前胡素液能明显缓解氯化钡引起的肠管平滑肌痉挛,白当归素无明显作用。

3.3 抗肿瘤实验

结果见表 3。异欧前胡素、水合氧化前胡素均有抗肿瘤作用,对 HL-60、HELA、P388、A549等 4种细胞株的生长均有显著抑制作用,并呈明显的量效关系。而欧前胡素、白当归素未观察到明显作用。

表 3 四种呋喃香豆素对肿瘤细胞株的抑制作用(n=3)Table 3 The inhibition ratio of 4 furocoumarins on 6 tumor cells

注:+有活性;-无活性。Note:+positive;-Negative.

4 讨论

白芷及其某些复方制剂在临床上广泛用于头痛、牙痛、三叉神经痛等多种疼痛的治疗,疗效显著,但目前白芷镇痛的有效成分尚不明确。本实验首次发现白芷中的欧前胡素、异欧前胡素具有明显的镇痛作用,除能直接对抗由热、醋酸等物理、化学刺激引起的疼痛外,还能缓解平滑肌痉挛,是白芷镇痛的活性成分。此外,本实验还发现白芷中的异欧前胡素、水合氧化前胡素具有明显抗肿瘤作用。上述研究为白芷的临床应用提供了科学依据。

目前中国药典仅规定白芷中欧前胡素的含量,我们发现异欧前胡素、水合氧化前胡素等成分亦具有明显的镇痛、解痉活性。文献也报道异欧前胡素具明显解痉作用及光敏活性[8]。结合白芷的功效,建议将异欧前胡素、水合氧化前胡素也作为白芷质量控制指标。

本文所采用的 4种香豆素为白芷的主要成分,结构均为线型呋喃香豆素,母核相同,仅取代基及取代位置不同。但它们在镇痛、缓解平滑肌痉挛、细胞毒等方面的作用均有明显差异,提示取代基的类型及取代位置对线型呋喃香豆素的生物活性具有显著影响。白芷中线型呋喃香豆素类成分的构效关系值得进一步研究。

致谢抗肿瘤活性测试由国家新药筛选中心完成;乙醇提取工作由四川省人民医院药学部完成;成都中医药大学黄国钧教授、唐声武教授、蒋桂华副教授提供了必要帮助,在此一并表示感谢。

1 Wang MY(王梦月),Jia MR(贾敏如),Ma YY(马逾英),eta l.Pharmacological effect of the total coumarins in radix Angelicae dahuricae.LiShiZhen Med Mater Med Res(时珍国医国药),2005,16:954-956.

2 Qin XH(秦旭华),Li ZL(李祖伦),Zhu GF(朱果夫),et al.Study on the pharmacodynam ics of total coumarin of Radix angelicae dahuricae in treatingmigraine.JSichuan Trad Chin Med(四川中医),2008,26(6):4-6.

3 Okuyama T,Takata M,Nishino H,et al.Studies on the antitumor-p romotingactivity of naturally occurring substancesⅡ.Inhibition of tumor p romtoter-enhanced phospholipidmetabolism by umbelliferousmaterials.Chem Pharm Bull,1990,38(4):1084.

4 Wang MY(王梦月),Jia MR(贾敏如).Research progress on chem ical constituents of Radix angelicae dahuricae.J Chin Med Maters(中药材),2002,25:446-449.

5 Zhang MF(张明发),Shen YQ(沈雅琴),Tang CK(汤臣康).Anti-inflammatory and analgesic actions of berberine.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),1990,2(1):49-53.

6 Chen Q(陈奇),Shen YJ(沈映君),Sun XH(孙学蕙),et al.TCMs Pharmacological Experiment(中药药理实验).Guiyang:Guizhou People's Publishing House,1988.105-107.

7 Xu SY(徐叔云),Bian RL(卞如濂),Chen X(陈修).Pharmacological ExperimentMethodology,3rd ed(药理实验方法学).Beijing:People's Medical Pub lishing House,2002.1784-1786.

8 Wang JW(江纪武),Xiao QX(肖庆祥).Handbook of Active Constituents in Phytomedicine(植物药有效成分手册).Beijing:People'sMedical Publishing House,1986.603.