一测多评法测定无硫和低硫白芷中5种香豆素类成分的含量

张 强，宋 宝，谢冬梅， 2，王国凯

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012)

白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.或杭白芷A.dahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根[1]，具有祛风散寒、通窍止痛、消肿排脓、生肌起痿、燥湿止带之功效[2-3]。香豆素类成分是白芷中主要成分[4-5]。

一测多评法是利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，只测定一个成分从而实现多个成分的同步测定，是一种较为简单易行的中药多指标评价的新方法与多指标质量评价的新模式[6]。杨芳等[7]建立一测多评法测定川白芷药材中欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的含量，可准确控制川白芷的质量。

商品白芷经过硫磺熏蒸，其有效成分含量会明显降低[8]。如何建立一种简便、易行、快捷的方法比较无硫和低硫白芷的质量差异，是目前整体评价无硫和低硫白芷质量的难题。本研究建立了一测多评方法比较无硫和低硫白芷中欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯及水合氧化前胡素等5种香豆素类成分的含量，以期为评价白芷药材质量提供依据。

1 试药与仪器

1.1 试药 甲醇(色谱纯)：德国Merck公司；水为超纯水；水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素对照品(批号分别为CFS201801、CFS201801、CFS201802、CFS201802，纯度均为98%)：武汉天植生物技术有限公司；异欧前胡素(批号110827-201812)：中国食品药品检定研究院。白芷药材2017年收集于安徽亳州、四川遂宁、河南禹州等地(见表1)，由安徽中医药大学生药系谢冬梅副教授鉴定为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.的干燥根。

表1 白芷样品表

1.2 仪器 高效液相色谱仪(Agilent 1100、Shimadzu LC-16型及Thermo U3000型)；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AX324ZH型电子天平：奥豪斯仪器有限公司；AB135-S电子天平：瑞士梅特勒托利多公司；JK-450B型超声仪：合肥金克尼机械制造有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素及异欧前胡素对照品，加甲醇溶解，定容，制得水合氧化前胡素0.495 mg/mL、佛手柑内酯0.195 mg/mL、氧化前胡素0.995 mg/mL、欧前胡素2.000 mg/mL及异欧前胡素0.995 mg/mL混合对照品溶液。过0.22 μm微孔滤膜，待用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取白芷药材粉末(过3号筛)约0.5 g，精密称定，置50 mL离心管中，加甲醇25 mL，称质量，超声(功率为300 W，频率为50 kHz)提取1 h后，冷却至室温，甲醇补足质量，离心(温度为4 ℃，转速为3 000 r/min，离心时间为5 min)，静置，吸取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，水(A)-甲醇 (B)流动相，梯度洗脱(见表2)；流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长300 nm，进样量10 μL。见图1。

表2 梯度洗脱程序

图1对照品(A)与白芷样品(B)的高效液相色谱图(1.水合氧化前胡素；2.佛手柑内酯；3.氧化前胡素；4.欧前胡素；5.异欧前胡素)

2.1.4 线性关系考察 将“2.1.1”项下对照品溶液分别精密吸取0.2、0.4、0.8、2.0、4.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，按“2.1.3”项下的色谱条件测定，记录。以白芷的5个对照品溶液浓度(ρ)为横坐标，以对应对照品的峰面积(A)为纵坐标，建立标准曲线。见表3。

表3 香豆素成分的线性关系

2.1.5 精密度试验 取混合对照品溶液，重复进样6次，测定，记录峰面积， RSD值分别为0.26%，0.47%，0.12%，0.07%，0.16%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 选取1号样品，按“2.1.2”项方法制得供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h测定，记录峰面积。结果RSD值分别为2.04%、1.67%、1.73%、1.73%、1.56%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 选取1号样品，平行6份，精密称定，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，测定并记录峰面积计算其含量，结果RSD值分别为1.25%、0.89%、1.32%、0.96%、1.12%。结果表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取14号样品6份，分别加入一定量对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。测定并记录峰面积，计算回收率，见表4。结果表明水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素及异欧前胡素平均回收率分别为96.74%、99.69%、100.26%、99.48%、101.74%，RSD值分别为0.82%、0.97%、0.77%、0.65%、0.33%。说明该方法的加样回收率良好。

2.2 相对校正因子的确定

2.2.1 相对校正因子的计算 根据在色谱定量分析的基本理论，高效液相响应值的大小与各物质的质量呈线性关系，即m=f·A。相对校正因子fi/s=fi/fs=(Ai×ms)/(mi×As)，其中As为内标物峰面积，ms为内标物的质量，Ai为待测成分i的峰面积，mi为待测成分i的质量。取“2.1.1”项下对照品溶液。按“2.1.3”项下色谱条件，改变进样量为2、4、8、10、20 μL，记录峰面积，计算各校正因子。见表5。

表4 加样回收率试验结果(n=6)

表5 以欧前胡素为内标、其余4个香豆素类

注：f1为f(欧前胡素/水合氧化前胡素)；f2为f(欧前胡素/佛手柑内酯)；f3为f(欧前胡素/氧化前胡素)；f4为f(欧前胡素/异欧前胡素)；各校正因子均为平行测定3次结果的均值

2.2.2 仪器和色谱柱的考察 取“2.1.1”项下对照品溶液，在“2.1.3”项下的色谱条件，平行进样3次，得各峰面积平均值，计算各相对校正因子，由表6可知RSD均小于3.0%，结果表明不同高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子无显著影响。见表6。

2.2.3 不同柱温、流速对校正因子的影响 同一色谱条件下，考察25、30、35 ℃柱温、考察0.9、1.0、1.1 mL/min流速对校正因子的影响。由表7可知，柱温及流速的变化对相对校正因子无显著影响。

表6 不同仪器和不同色谱柱测定的相对校正因子值(n=3)

注：f1为f(欧前胡素/水合氧化前胡素)，f2为f(欧前胡素/佛手柑内酯)，f3为f(欧前胡素/氧化前胡素)，f4为f(欧前胡素/异欧前胡素)

2.2.4 待测成分色谱峰的定位 在确定各待测成分的位置时，选取保留时间差值和相对保留时间值两种方法定位。为了增加定位各组分的可信度，采用了不同的高效液相色谱仪和不同色谱柱进行定位考察。由表8可知t(欧前胡素/水合氧化前胡素)、t(欧前胡素/佛手柑内酯)、t(欧前胡素/氧化前胡素)、t(欧前胡素/异欧前胡素)、Δt(欧前胡素/水合氧化前胡素)、Δt(欧前胡素/佛手柑内酯)、Δt(欧前胡素/氧化前胡素)、Δt(欧前胡素/异欧前胡素)的RSD分别为1.94%、2.15%、0.86%、1.76%、19.43%、32.49%、50.88%、39.27%。结果表明相对保留时间的重复性较好。

2.3 一测多评法与外标法的比较 精密称取20批药材粉末0.5 g，按“2.1.2”项方法制成供试品溶液，进样，记录峰面积，采用外标法和一测多评法分别计算各成分的含量。由表9可知两种方法所测得5种香豆素成分含量结果基本一致，表明一测多评法在无硫和低硫白芷多成分测定是可行的。

表7 不同流速对白芷4种校正因子的影响(n=3)

注：f1为f(欧前胡素/水合氧化前胡素)，f2为f(欧前胡素/佛手柑内酯)，f3为f(欧前胡素/氧化前胡素)，f4为f(欧前胡素/异欧前胡素)

表8 相对保留值及保留时间差值的比较(n=3)

注：t1为t(欧前胡素/水合氧化前胡素)，t2为t(欧前胡素/佛手柑内酯)，t3为t(欧前胡素/氧化前胡素)，t4为t(欧前胡素/异欧前胡素)；相对保留时间为欧前胡素与水合氧化前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素的保留时间之比，保留时间差的绝对值为各物质与欧前胡素保留时间差值的绝对值

表9 外标法和一测多评法测定无硫和低硫白芷中5种成分的含量

3 讨论

前期研究基础结合相关文献[9-11]，确定色谱条件为甲醇-水系统，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，波长为300 nm，流速为1.0 mL/min。该方法分离度良好，可以对白芷多成分进行定量分析。

本研究通过一测多评对水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素及异欧前胡素5种白芷中香豆素类成分含量进行了测定。通过不同仪器、色谱柱、进样量、流速及柱温可知相对校正因子的RSD值均小于3.0%，说明各因素对相对校正因子无显著性影响，确立的4种校正因子适用于白芷的一测多评法含量测定。与无硫相比，低硫白芷各成分含量均有下降，且佛手柑内酯与氧化前胡素最为明显。仅有部分低硫白芷欧前胡素含量符合2015年版《中华人民共和国药典》规定，说明仅以欧前胡素含量为限量指标不足以全面控制白芷质量。

研究结果表明外标法和一测多评法测定白芷中5种香豆素成分的含量无显著性差异，说明该方法不仅可用于白芷中5种香豆素类成分同时测定，还可以用来控制硫熏白芷的临床安全性。采用一测多评法不仅对现有质量控制方法有提升，而且还更快捷、可靠。