欧前胡素下调MCL-1提高口腔鳞癌干细胞顺铂敏感性实验研究

徐旭

欧前胡素下调MCL-1提高口腔鳞癌干细胞顺铂敏感性实验研究

徐旭

目的探讨中药白芷活性成分欧前胡素增强顺铂对口腔鳞癌干细胞的杀伤活性及其机制。方法流式细胞术检测欧前胡素和顺铂对Cal27细胞系的肿瘤干细胞种群比例的影响。MTT法和Annexin V染色法检测欧前胡素对顺铂杀伤Cal27肿瘤干细胞能力的影响。利用Western blot方法验证欧前胡素是否调节Cal27肿瘤干细胞MCL-1的表达。运用JC-1染色、Annexin V染色及Western blot方法研究欧前胡素影响顺铂疗效的信号通路。结果顺铂组Cal27细胞系的肿瘤干细胞种群比例显著高于对照组（19.4%比8.5%，P＜0.05），而顺铂联合欧前胡素组后肿瘤干细胞种群比例下降至11.5%（P＜0.05）。顺铂联合欧前胡素组对Cal27肿瘤干细胞的细胞活力的抑制率为（57.4± 3.4）%，凋亡诱导率为（36.7±2.1）%，均显著高于欧前胡素组的（7.9±6.6）%与（4.2±0.4）%（P＜0.05）和顺铂组的（11.8±0.8）%与（8.4±0.5）%（P＜0.05）。顺铂联合欧前胡素组Cal27肿瘤干细胞的线粒体膜电位显著低于欧前胡素组和顺铂组（0.37±0.02比0.96±0.04、0.86±0.03，P＜0.05）。顺铂联合欧前胡素组处理的Cal27肿瘤干细胞的caspase-9和caspase-3的活化水平分别为0.48±0.03、0.56±0.04，显著高于欧前胡素组的0.03±0.01（P＜0.05）、0.03±0.01（P＜0.05）和顺铂组的0.10±0.02（P＜0.05）、0.12± 0.02（P＜0.05）。与对照组比较，欧前胡素处理后Cal27肿瘤干细胞的MCL-1表达水平显著降低（0.29±0.02比0.89±0.05，P＜0.05），而顺铂对MCL-1的表达无影响（0.90±0.05比0.89±0.05，P＞0.05）。结论欧前胡素可通过下调MCL-1的表达提高口腔鳞癌干细胞对顺铂的敏感性。

口腔鳞癌干细胞；MCL-1；欧前胡素；顺铂；线粒体；凋亡

肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小群具有高度致瘤性的细胞，它们具有干细胞样的特征，能快速自我更新，导致肿瘤的术后复发且对化疗有较强的抵抗性[1-2]。口腔鳞癌是危害人类健康的常见肿瘤之一，尽管现在治疗手段有了很大的进步，但该病预后仍不十分理想，患者的五年存活率仍很低[3]，对于不能进行手术的患者，化疗是重要的治疗手段，因此提高肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性有十分重要的意义。本文目的在于研究欧前胡素是否能增强顺铂对口腔鳞癌干细胞的杀伤活性并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 噻唑蓝（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、欧前胡素、顺铂、Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（美国 Sigma-Aldrich）。细胞蛋白提取液、髓细胞白血病基因1 （MCL-1）抗体、活化型半胱天冬酶-9（cleaved caspase-9）抗体、活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）抗体和β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Cell Signaling）。JC-1染料（江苏碧云天生物科技有限公司）。CD44流式抗体 （美国 SantaCruz）。脂质体 2000 （Lipofectamine 2000）（美国Invitrogen）。增强型化学发光底物（ECL）试剂盒（美国Pierce）。

1.2 细胞培养 人口腔鳞癌细胞系Cal27购于美国美国模式菌种收集中心（ATCC）。Cal27肿瘤干细胞用流式细胞仪进行分选，CD44阳性的Cal27细胞即为Cal27肿瘤干细胞[4]。所有肿瘤细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.3 质粒构建和转染 将MCL-1基因cDNA全长序列（Gene ID：NM_001197320）以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成MCL-1重组真核表达质粒[5]。使用Lipofectamine 2000按照试剂操作说明书步骤将2μg/mL MCL-1质粒转染入Cal27肿瘤干细胞中。

1.4 Cal27肿瘤干细胞所占比例测定 将Cal27细胞按1×106/孔接种在6孔板上，分为对照组、欧前胡素组、顺铂组、顺铂+欧前胡素组并按文献所述进行处理[6]。对照组为Cal27细胞不加药物培养48h，顺铂组在Cal27细胞中加入5μmol/L的顺铂培养48h，欧前胡素组在Cal27细胞中加入10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素组在Cal27细胞中加入5μmol/L的顺铂和10μmol/L的欧前胡素培养48h。药物处理完毕后将细胞用生理盐水洗涤两次，加入CD44抗体在暗处孵育20min后将细胞用流式细胞仪进行分析，计算CD44阳性的Cal27细胞所占总的Cal27细胞的比例。

1.5 细胞活力检测 Cal27肿瘤干细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、欧前胡素组、顺铂组、顺铂+欧前胡素组和顺铂+欧前胡素+MCL-1质粒组。对照组为Cal27肿瘤干细胞不加药物培养48h，顺铂组在Cal27肿瘤干细胞中加入5μmol/L的顺铂培养48h，欧前胡素组在Cal27肿瘤干细胞中加入10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素组在 Cal27肿瘤干细胞中加入 5μmol/L的顺铂和10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素+ MCL-1质粒组先将 2μg/mL的 MCL-1质粒用Lipofectamine 2000转染入Cal27肿瘤干细胞培养24h，之后更换培养基再加入5μmol/L的顺铂和10 μmol/L的欧前胡素继续培养48h。药物处理完毕后在培养体系中加入20μL 5g/L MTT再培养4h，弃去上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，在570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD治疗组）/OD对照组×100%。

1.6 细胞凋亡实验 Cal27肿瘤干细胞按2×106/孔接种在6孔板上，分为对照组、欧前胡素组，顺铂组、顺铂+欧前胡素组和顺铂+欧前胡素+MCL-1质粒组。对照组为Cal27肿瘤干细胞不加药物培养48h，顺铂组在Cal27肿瘤干细胞中加入5μmol/L的顺铂培养48h，欧前胡素组在Cal27肿瘤干细胞中加入10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素组在Cal27肿瘤干细胞中加入5μmol/L顺铂和10μmol/L欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素+MCL-1质粒组先将2μg/mL的MCL-1质粒用Lipofectamine 2000转染入Cal27肿瘤干细胞培养24h，之后更换培养基再加入5μmol/L的顺铂和10μmol/L的欧前胡素继续培养48h。药物处理完毕后将细胞用生理盐水洗涤两次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.7 Western blot实验 将Cal27肿瘤干细胞按2× 106/孔接种在6孔板上，分为对照组、欧前胡素组、顺铂组、顺铂+欧前胡素组和顺铂+欧前胡素+MCL-1质粒组。对照组为Cal27肿瘤干细胞不加药物培养48h，顺铂组在Cal27肿瘤干细胞中加入5μmol/L的顺铂培养48h，欧前胡素组在Cal27肿瘤干细胞中加入10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素组在 Cal27肿瘤干细胞中加入 5μmol/L的顺铂和10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素+ MCL-1质粒组先将2μg/mL的MCL-1质粒用Lipofectamine 2000转染入Cal27肿瘤干细胞培养24h，之后更换培养基再加入5μmol/L的顺铂和10μmol/L的欧前胡素继续培养48h。药物处理完毕后将细胞用生理盐水洗涤两遍并提取总蛋白质。将蛋白提取液用12.5%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用 MCL-1抗体、cleaved caspase-9抗体、cleaved caspase-3抗体或β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。蛋白灰度值分析用Image J软件处理。目标蛋白的相对表达水平用其蛋白灰度值与βactin灰度值的比值表示。

1.8 线粒体膜电位测定 线粒体膜电位用JC-1染色进行测定[7]。将Cal27肿瘤干细胞按2×106/孔接种在6孔板上，分为对照组、欧前胡素组、顺铂组、顺铂+欧前胡素组。对照组为Cal27肿瘤干细胞不加药物培养48h，顺铂组在Cal27肿瘤干细胞中加入5μmol/L的顺铂培养48h，欧前胡素组在Cal27肿瘤干细胞中加入10μmol/L的欧前胡素培养48h，顺铂+欧前胡素组在Cal27肿瘤干细胞中加入5μmol/L的顺铂和10μmol/L的欧前胡素培养48h。药物处理完毕后将细胞用生理盐水洗涤两遍，加入JC-1染料在暗处孵育20min，再用生理盐水洗涤两遍后用流式细胞仪检测JC-1的荧光强度。治疗组的相对线粒体膜电位为各治疗组的JC-1荧光强度与对照组荧光强度的比值。

2 结果

2.1 欧前胡素显著提高顺铂对Cal27肿瘤干细胞的杀伤活性 流式细胞实验结果表明，顺铂单独治疗可提高Cal27细胞系中的肿瘤干细胞种群比例，而联用欧前胡素后，Cal27肿瘤干细胞的比例受到抑制而显著下降（P＜0.05），见表1。细胞活力实验和凋亡实验结果表明联用欧前胡素后，顺铂对Cal27肿瘤干细胞的杀伤活性显著增强，见表2。

表1 欧前胡素减弱顺铂对Cal27肿瘤干细胞种群比例的影响（±s）

表1 欧前胡素减弱顺铂对Cal27肿瘤干细胞种群比例的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与顺铂+欧前胡素组比较，#P＜0.05

表2 欧前胡素显著提高顺铂对Cal27肿瘤干细胞的抗肿瘤活性（±s）

表2 欧前胡素显著提高顺铂对Cal27肿瘤干细胞的抗肿瘤活性（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与顺铂+欧前胡素组比较，#P＜0.05

组别对照组顺铂组欧前胡素组顺铂+欧前胡素组孔数 顺铂（μmol/L）欧前胡素（μmol/L）3 3 3 3 0 5 0 5 0 0 1 0 10细胞活力抑制率（%）0 11.8±0.8*#7.9±0.6*#57.4±3.4凋亡诱导率（%）2.1±0.3 8.4±0.5*#4.2±0.4*#36.7±2.1*

2.2 欧前胡素通过线粒体途径提高Cal27肿瘤干细胞对顺铂的敏感性 实验结果表明，欧前胡素能显著增强顺铂对Cal27肿瘤干细胞线粒体膜电位的损伤，进而诱导Cal27肿瘤干细胞中caspase-9和caspase-3的活化，见表3。

2.3 欧前胡素通过下调MCL-1的表达水平增强Cal27肿瘤干细胞对顺铂的敏感性 实验结果发现，欧前胡素能显著下调Cal27肿瘤干细胞中抗凋亡蛋白MCL-1表达水平，而顺铂对MCL-1的表达无影响。将Cal27肿瘤干细胞用MCL-1质粒进行转染后再用顺铂联合欧前胡素进行治疗，发现MCL-1质粒能显著抑制顺铂联合欧前胡素对Cal27肿瘤干细胞的杀伤活性和凋亡诱导效应，见表4。

3 讨论

欧前胡素是从白芷根中提取的香豆素类天然活性物质，据报道有一定的抗肿瘤效应，并且能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤活性[6，8]，然而其对肿瘤干细胞的生物作用至今却仍很少报道。本研究发现，欧前胡素能显著提高口腔鳞癌干细胞对顺铂的敏感性，证实欧前胡素联合化疗药物对肿瘤干细胞治疗存在协同效应。

表3 欧前胡素通过线粒体途径提高Cal27肿瘤干细胞对顺铂的敏感性（±s）

表3 欧前胡素通过线粒体途径提高Cal27肿瘤干细胞对顺铂的敏感性（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.0；与顺铂+欧前胡素组比较，#P＜0.05；cleaved caspase：活化型半胱天冬酶

?

表4 欧前胡素通过MCL-1途径提高顺铂对Cal27肿瘤干细胞的抗肿瘤活性（±s）

表4 欧前胡素通过MCL-1途径提高顺铂对Cal27肿瘤干细胞的抗肿瘤活性（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.0；与顺铂+欧前胡素组比较，#P＜0.05。MCL-1：抗凋亡蛋白

组别对照组顺铂组欧前胡素组顺铂+欧前胡素组顺铂+欧前胡素+MCL-1质粒组孔数 顺铂（μmol/L）欧前胡素（μmol/L）MCL-1质粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 5 0 5 5 0 0 1 0 10 10 0 0 0 0 2 MCL-1相对表达水平0.89±0.05 0.90±0.05*#0.29±0.02* 0.31±0.02 0.97±0.06#细胞活力抑制率（%）0 12.0±0.8*#7.8±0.6*#58.6±3.3 18.4±1.1#细胞凋亡诱导率（%）2.2±0.3 8.5±0.6*#4.1±0.4*#37.3±2.2 9.9±0.7#

近期研究发现，肿瘤干细胞的存在是引起肿瘤化疗失败的关键因素，肿瘤干细胞的高度自我更新能力和对化疗药物的抵抗性往往导致肿瘤的复发[9-10]。本研究发现，当用顺铂单独处理口腔鳞癌细胞系Cal27后，Cal27细胞系中CD44阳性的肿瘤干细胞比例显著提高，这可能是因为肿瘤干细胞对顺铂的敏感性显著低于非肿瘤干细胞，致使Cal27肿瘤干细胞在顺铂治疗下存活下来从而引起所占比例的升高。当用欧前胡素进行联合治疗后，由于Cal27肿瘤干细胞在欧前胡素的作用下对顺铂的敏感性显著提高，使肿瘤干细胞的占比显著下降，表明欧前胡素能以肿瘤干细胞为靶点提高顺铂对口腔鳞癌的治疗效果。

CL-1是Bcl-2抗凋亡蛋白家族成员，定位于线粒体外膜上，通过与一些促凋亡蛋白如Bim、Bak和NOXA等形成异二聚体使之失活从而稳定线粒体外膜，它能阻断细胞色素C等促凋亡物质从线粒体中释放进而发挥抗凋亡作用[11-12]。有研究发现，MCL-1在多种肿瘤细胞中均高表达，且MCL-1的表达程度与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性呈负相关[13-14]。在本研究中，欧前胡素在Cal27肿瘤干细胞中的直接靶点是MCL-1蛋白，它能显著降低Cal27肿瘤干细胞中MCL-1的表达水平。当在口腔鳞癌干细胞中转染MCL-1质粒增加它的表达水平后，欧前胡素联合顺铂对肿瘤干细胞线粒体的损伤作用受到显著抑制，降低细胞活力抑制力和细胞凋亡诱导率。表明欧前胡素通过抑制MCL-1的表达发挥对顺铂的协同作用，这些结果均与文献报道一致。

本研究结果显示，欧前胡素能显著提高口腔鳞癌干细胞对顺铂的敏感性。其机制为欧前胡素通过下调MCL-1的表达促进顺铂对肿瘤干细胞线粒体的损伤作用，进而诱导细胞caspase的活化和凋亡的发生。这些研究为如何提高顺铂治疗效果提供了新的思路和理论依据。

［1］Reya T，Morrison SJ，Weissman IL，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414（6859）：105-111.

［2］Chuthapisith S，Eremin J，Eremin O，et al.Breast cancer chemoresistance：emerging importance of cancer stem cells ［J］.Surgical Oncology，2010，19（1）：27-32.

［3］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013 ［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［4］Gemenetzidis E，Gammon L，Mackenzie IC，et al.Invasive oralcancerstem cellsdisplay resistance to ionising radiation［J］.Oncotarget，2015，6（41）：43964-43977.

［5］Sun JG，Xiang J，Liu FY，et al.Clitocine induces apoptosis and enhances the lethality of ABT-737 in human colon cancer cells by disrupting the interaction of Mcl-1 and Bak ［J］.Cancer Lett，2014，355（2）：253-263.

［6］Hu J，Xu C，Pan C，et al.Imperatorin acts as a cisplatin sensitizer via downregulating Mcl-1 expression in HCC chemotherapy［J］.Tumour Biol，2016，37（1）：331-339.

［7］Prathapan A，Vineetha VP，Raghu KG.Protective effect of Boerhaavia diffusa L.against mitochondrial dysfunction in angiotensin II induced hypertrophy in H9c2 cardiomyoblast cells［J］.PLoS One，2014，9（4）：e96220.

［8］J.Jakubowicz-Gil，R.Paduch，A.Gawron，et al.Cell death in HeLa cells upon imperatorin and cisplatin treatment［J］. Folia Histochem Cytobiol，2012，50（3）：381-391.

［9］Zhang HL，Wang P，Zhang SD，et al.c-Myc regulation of ATP-binding cassette transporter reverses chemoresistance in CD133（+）colon cancer stem cells［J］.Sheng Li Xue Bao，2016，68（2）：171-178.

［10］Mohammed MK，Shao C，Lee MJ，et al.Wnt/β-catenin signaling plays an ever-expanding role in stem cell selfrenewal，tumorigenesis and cancer chemoresistance［J］. Genes Dis，2016，3（1）：11-40.

［11］Rahmani M，Aust MM，Grant S，et al.PI3K/mTOR inhibition markedly potentiates HDAC inhibitor activity in NHL cells through BIM-and MCL-1-dependent mechanisms in vitro and in vivo［J］.Clin Cancer Res，2014，20（18）：4849-4860.

［12］Beekman AM，Howell LA.Small-Molecule and Peptide Inhibitors of the Pro-Survival Protein Mcl-1［J］.Chemmedchem，2016，11（8）：802-813.

［13］Pei XY，Dai Y，Grant S，et al.Circumvention of Mcl-1-dependent drug resistance by simultaneous Chk1 and MEK1/2 inhibition in human multiple myeloma cells［J］. PLoS One，2014，9（3）：e89064.

［14］Williams MM，Cook RS.Bcl-2 family proteins in breast development and cancer：could Mcl-1 targeting overcome therapeutic resistance?［J］.Oncotarget，2015，6（6）：3519-3530.

（收稿：2016-06-03 修回：2016-07-04）

Imperatorin Increased the Sensitivity of Oral Cancer Stem Cells to Cisplatin Via Down-regulating the Ex-pression of MCL-1

XU Xu.Department of Stomatology,Quzhou People's Hospital,Quzhou(324000),China

ObjectiveTo investigate the role of imperatorin in cisplatin-induced cell death in oral cancer stem cells and the underlying mechanism.MethodsThe percentage of cancer stem cell population in the Cal27 cell line treated with imperatorin and cisplatin was assessed by flow cytometry.MTT assay and Annexin V staining was performed to evaluate the effect of imperatorin on the cisplatin-induced cell death and apoptosis in the Cal27 cancer stem cells.ResultsThe Cal27 cancer stem cell population in single cisplatin treatment group was significantly higher than that in control group (19.4%vs 8.5%,P＜0.05),but lower than 11.5%of cisplatin plus imperatorin group(P＜0.05).The inhibitory rate of cell viability and the apoptotic rate of Cal27 cancer stem cells in cisplatin plus imperatorin group was 57.4%±3.4%and 36.7%±2.1%,respectively,which were significantly higher than those in single cisplatin group(7.9%±6.6%and 4.2%±0.4%,P＜0.05)and single imperatorin group(11.8%±0.8%and 8.4%±0.5%,P＜0.05).The mitochondrial transmembrane potential of Cal27 cancer stem cells in cisplatin plus im peratorin group was significantly lower than that in single cisplatin group and single imperatorin group(0.37±0.02 vs 0.96±0.04,0.86±0.03,all P＜0.05).The relative expression of cleaved caspase-9 and caspase-3 in cisplatin plus imperatorin group was significantly higher than that in single cisplatin group and imperatorin group (caspase-9：0.48±0.03 vs 0.03±0.01,0.10±0.02;caspase-3：0.56±0.04 vs 0.03±0.01,0.12±0.02;all P＜0.05).Treatment with im peratorin significantly decreased the expression of MCL-1(0.29±0.02 compared with 0.89±0.05 in control group,P＜0.05), whereas the cisplatin treatment did not change the MCL-1 level(0.90±0.05 vs 0.89±0.05,P＞0.05).Transfectionwith MCL-1 vector significantly impaired the synergistic effect of imperatorin on the cisplatin-induced cell death and apoptosis in the Cal27 cancer stem cells.ConclusionImperatorin increased the sensitivity of oral cancer stem cells to cisplatin via down-regulating the expression of MCL-1.

oral cancer stem cells;MCL-1;imperatorin;cisplatin;mitochondria;apoptosis

浙江省衢州市人民医院口腔科（衢州 324000）