UPLC-FLD 法同时测定不同产地白芷中5 种香豆素

李 乾，刘 洁，李月婷，阳 娇，赵淑军，肖红斌，3*

（1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2.北京中医药大学，中药分析与转化研究中心，北京 100029；3.北京中医药大学北京中医药研究院，北京 100029；4.北京中医药大学中药学院，北京 100029）

白芷为伞形科植物植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ExHoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.Ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan 的干燥根，味辛、性温，归胃、大肠、肺经，具有发散风寒、通窍止痛、燥湿止带、消肿排脓等功效，临床常用于治疗阳明头痛、眉棱骨痛、鼻渊头痛、牙痛、风寒湿痹、疮疡肿毒等病症［1］。白芷含有的化学成分主要有香豆素类、挥发油类、多糖类、甾醇类及生物碱等［2-4］。文献报道其有效成分主要为欧前胡素、异欧前胡素等香豆素类［5-7］。2015 年版《中国药典》一部以欧前胡素为指标成分来评价白芷质量，欧前胡素的总量不得低于0.080%［1］。近年来有文献表明欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、水合氧化前胡素能够进入血液及脑脊液［8-9］且佛手柑内酯［10-12］、氧化前胡素［13-14］均有明显的抗炎抗肿瘤作用。因此，仅以欧前胡素作为评价指标，不能全面地评价白芷的质量。

HPLC 法是目前测定白芷中香豆素含有量的主要方法［15］，也有超临界流体色谱法［16］、近红外光谱法［17］、LC-MS 法［18］等。白芷中的水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素，具有苯环（π*-π*）结构特征，其有较强的荧光吸收。荧光分析方法具有选择性好，灵敏度高等特点，比紫外-可见分光光度法低3 个数量级以上。通过文献调研发现，相比于紫外检测器，荧光检测器有更好的选择性［19］；相比于三重串联四级杆质谱，荧光检测器花费更少［8］。此外，鉴于传统HPLC 方法测定白芷中香豆素类成分含有量耗时长，同时存在干扰峰的问题。因此，本研究以期开发保留时间更短、特异性和选择性更好的UPLC-FLD 测定方法，对白芷中5 种香豆素类成分同时测定，并对21 批不同产地白芷中5 种成分进行含有量测定，以期更准确的评价白芷药材的质量。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 超高效液相色谱仪、Agilent 1260 G1321B 荧光检测器（美国Agilent 公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（德国Millipore 公司）；AT201 型电子天平（1/10 万，瑞士Mettler Toledo 公司）；KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 对照品欧前胡素（O-001-170526）、异欧前胡素（Y-007-170426）、水合氧化前胡素（S-128-170426）、氧化前胡素（Y-151-180713）、佛手柑内酯（F-008-170426）均购于成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于98%。乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma 公司）。

1.3 样品 白芷药材购买于河北安国药材市场和安徽亳州药材市场，信息见表1，经北京中医药大学王学勇教授鉴定为正品，凭证样本留样存放于北京中医药大学中药分析与转化研究中心。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX ECLIPSE Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，10%～38% B，2～7 min，38%～39% B，7～9 min，39%～40% B，9～10 min，40%～55% B，10～14 min，55%～70%B，14～15 min，100% B）；体积流量0.4 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL。色谱图见图1。

图1 各成分荧光色谱图Fig.1 Fluorescence chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备 取对照品水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素适量，精密称定，加甲醇溶解并定容，制备成水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素质量浓度分别为20、20、200、200、100 μg/mL 的混合对照品溶液，4 ℃储存备用。

2.3 供试品溶液制备 精密称取白芷粉末（过5 号筛）约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（120 W，40 kHz）提取1 h，放冷。再次称定质量，用甲醇补足减失质量。摇匀，静置后取上清液，滤过，取续滤液即得。

2.4 最佳波长确定 将“2.2”项下对照品溶液，在“2.1”项条件下进样2 针，分别获取各化合物的激发波长（Ex）及发射波长（Em）曲线。获取Ex 曲线时，先固定Em（如500 nm），将Ex 处设置为“zero order”，采集范围设定为230～450 nm，扫描间隔为5 nm。获取Em 曲线时，先固定Ex（如250 nm），将Em 处设置为“zero order”，采集范围设定为300～600 nm，间隔为5 nm。分别进行数据采集，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密量取制备好的混合对照品贮备液，采用逐级稀释的方法，即得不同质量浓度的混合对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.2 定量下限 按10 倍信噪比计算，水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的定量下限分别为10、10、10、20、10 ng/mL。

2.5.3 精密度试验 取对照品溶液5 μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样7 针，水合氧化前胡素保留时间RSD 为0.06%，峰面积RSD 为0.92%；佛手柑内酯保留时间RSD 为0.08%，峰面积RSD 为0.80%；氧化前胡素保留时间RSD 为0.08%，峰面积RSD 为0.83%；欧前胡素保留时间RSD 为0.03%，峰面积RSD 为0.87%；异欧前胡素保留时间RSD 为0.03%，峰面积RSD 为0.96%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、4、8、12、24 h进样5 μL，测定水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的峰面积，其中RSD 分别为0.77%、0.76%、0.35%、0.70%、0.33%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批样品6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别进样。测得水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的平均含有量分别为0.36、0.35、3.76、2.84、1.08 mg/g，RSD 分别为2.56%、4.17%、1.81%、1.86%、1.02%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取已知含有量的四川白芷粉末0.5 g，分别精密加入混合对照品溶液1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算各成分回收率。结果见表3。

2.6 样品含有量测定 精密称取不同产地21 批白芷粉末各1 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以外标法计算水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的含有量，结果见表4。

3 讨论

3.1 荧光检测波长确定 按“2.4”项下方法得水合氧化前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的最大激发波长区间分别为259～262、259～262、255～258、253～254、259～260 nm，最大发射波长分别为494～498、495～500、486～490、484～487、484～487 nm。并以氧化前胡素为例展示其激发及发射波长曲线。为确保5 种成分同时均有较强吸收，最终确定了荧光检测器的Ex 为259 nm，Em 为490 nm。

3.2 色谱条件优化 在实验过程中，流动相为纯水-乙腈时，出现了拖尾现象。加入0.1%甲酸后能够有效改善峰拖尾现象。最后对梯度洗脱比例进行了摸索，在保证R≥1.5 的前提下，使分析时间在15 min 内达到全部分离。

3.3 荧光检测器与紫外检测器比较 荧光分析方法的主要优点是灵敏度高，选择性好，检测限达10-10g/mL，相较紫外-可见分光光度法低3 个数量级以上。本研究发现白芷样品的紫外色谱图在峰1（水合氧化前胡素）和峰3（氧化前胡素）处有其他物质干扰，而其荧光色谱图不存在干扰峰，且荧光色谱峰基线平稳。因此，本研究所建立的荧光检测方法图谱杂质干扰少，选择性强，分离度好，灵敏度高。

3.4 结果分析 2015 年版《中国药典》一部以欧前胡素为指标成分来评价白芷质量，欧前胡素的总量不得低于0.080%［1］。本研究采用UPLC-FLD 法

同时测定了不同地区共21 批样品中5 种香豆素的含有量，结果表明安徽白芷中欧前胡素含有量最高，达到3.26 mg/g；而陕西商洛白芷中欧前胡素含有量最低，低至0.36 mg/g。此外，结果表明，浙江白芷中水合氧化前胡素和氧化前胡素含有量最高，分别为0.73、0.95 mg/g；而河北白芷中佛手柑内酯和氧化前胡素含有量最高，分别为0.33、2.99 mg/g。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 不同产地样品中各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in samples from different growing areas（mg/g）

3.5 指标性成分选择 文献报道水合氧化前胡素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素可吸收进入血液［8］，且水合氧化前胡素、佛手柑内酯、异欧前胡素可透过血脑屏障到达脑组织［9］；此外，课题组利用UPLC-FLD 检测白芷入血成分时发现氧化前胡素也可吸收进入血液，表明这5 种成分均直接影响着白芷的临床疗效。当以5 种香豆素总含有量来评价白芷时，大部分产地中5 种香豆素总含有量较高，但陕西及湖南产地总香豆素含有量较低，5 种香豆素总含有量小于2.0 mg/g。本研究所得香豆素总含有量较高的产地与文献报道的白芷5 大产区河北（祁白芷）、河南（禹白芷）、四川（川白芷）、杭州（杭白芷）、安徽（亳白芷）相一致［20-21］。因此，建议将水合氧化前胡素、佛手柑内酯、异欧前胡素、欧前胡素、氧化前胡素这5 种成分作为白芷质量控制指标成分。

4 结论

本研究建立的UPLC-FLD 法选择性强，灵敏度高，重现性好，对不同产地白芷中5 种香豆素的含有量进行测定。该方法首次应用于白芷药材中香豆素含有量的检测，相较于紫外检测器，荧光检测器有其固有的特异性和选择性。以期为白芷药材的含有量测定提供一种新方法，也为中药复杂体系及体内香豆素类成分含有量测定提供参考。