欧前胡素下调Mcl-1蛋白表达诱导人肝癌细胞HepG2凋亡实验研究

俞方红黄晓燕

欧前胡素下调Mcl-1蛋白表达诱导人肝癌细胞HepG2凋亡实验研究

俞方红1黄晓燕2

目的 探讨欧前胡素对人肝癌细胞的抑制作用及机制。方法 将人肝癌细胞系HepG2用5、10、20、40、80μM的欧前胡素处理24h或48h，以相同培养条件不加欧前胡素的HepG2细胞为对照组，MTT法检测欧前胡素治疗后HepG2细胞的增殖抑制情况；HepG2细胞用10、20、40μM的欧前胡素处理24h，通过流式细胞术和Western blot检测欧前胡素对HepG2细胞的凋亡诱导作用和Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表达；在HepG2细胞中转染pcDNA-3.1-Mcl-1真核表达载体后再用欧前胡素治疗，检测欧前胡素对HepG2细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导效应。结果 10、20、40、80μM欧前胡素组增殖抑制率分别为24h：（7.2±1.7）%、（14.5±2.6）%、（37.4±3.7）%、（56.3± 4.3）%；48h：（14.5±2.1）%、（23.6±3.0）%、（52.3±4.8）%、（78.3±5.9）%，与对照组（0）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；10、20、40μM欧前胡素组凋亡诱导率分别为（3.9±0.8）%、（12.4±1.8）%、（26.9± 2.5）%，与对照组（0.5±0.2）%比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。欧前胡素治疗后，HepG2细胞的Mcl-1表达水平显著下降，用pcDNA-3.1-Mcl-1真核表达载体转染HepG2细胞后，欧前胡素对HepG2细胞的凋亡诱导率较空pcDNA3.1载体转染组显著下降［（6.8±1.2）%比（25.7±2.3）%，P＜0.05］。结论 欧前胡素具有体外抗肝肿瘤的生物活性，其抗肿瘤效应的机制可能是通过下调Mcl-1蛋白表达从而诱导细胞凋亡。

人肝癌细胞HepG2；欧前胡素；Mcl-1；凋亡

肝癌是我国死亡率最高的癌症之一[1]，手术和肝移植是早期肝癌最常用的治疗手段，且治愈率较高。但是超过80%的肝癌患者在被发现时已经处于中晚期，肿瘤组织往往难以切除并伴随转移灶，预后很差，只能采取化疗手段治疗[2]。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物的重要机制，然而长期化疗常常造成肿瘤细胞通过抵抗凋亡而对化疗药物耐药[3]，因此寻找新的治疗方法十分重要。欧前胡素是从白芷根中提取的香豆素类天然活性物质，据报道有十分良好的抗肿瘤效应[4]。欧前胡素对肝肿瘤的抑制效应及机制目前仍不清楚，笔者观察欧前胡素对人肝癌细胞的抑制作用及机制，发现欧前胡素可显著抑制肝肿瘤细胞的生长，其机制可能在于通过下调Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肝癌细胞系HepG2为本院临床检验实验室保存，购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，培养在DMEM培养基中，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 试 剂 DMEM培养基（批号：11995-065），购于美国Gibco公司。欧前胡素（批号：I6659）、噻唑蓝（MTT，批号：M2128），均购于Sigma-Aldrich。PI/AnnexinⅤ凋亡试剂盒（批号：88-8005-74），购于美国ebioscience。细胞蛋白裂解液（批号：#9803），切割型PARP抗体（cleaved PARP，批号：#9541，仅识别切割型PARP抗体，不能识别全长PARP），Mcl-1抗体（批号：#5453）及β-actin抗体（批号：#4967），均购于美国cell signaling公司。PVDF膜购于美国Millipore公司（批号：IPVH00010）。pcDNA3.1（批号：V790-20），转染试剂Lipofectamine2000（批号：11668030），Trizol（批号：15596-018），均购于Invitrogen公司。ECL显色试剂盒（批号：W1001），购于promega公司。

1.3 MTT试验 将HepG2细胞按1000个/孔接种于96孔板，加入200μL DMEM培养，设置3个复孔，分别加入5、10、20、40、80μM的欧前胡素培养24、48h，对照组为不加欧前胡素同样条件培养24、48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞增殖抑制率用以下公式计算：抑制率=（对照组OD值-欧前胡素组OD值）/对照组OD值×100%。

1.4 细胞凋亡试验 HepG2细胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法检测。在HepG2细胞培养瓶中分别加入10、20、40μM的欧前胡素培养24h，对照组为不加欧前胡素同样条件培养24h，将5μL Annexin V/PI检测液加入细胞中37℃孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡。细胞凋亡率用Annexin V阳性细胞占所有细胞比值表示[5]。

1.5 Western blot试验 在HepG2细胞培养瓶中分别加入10、20、40μM的欧前胡素培养24h，收集细胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺进行SDS-PAGE，之后将凝胶取下将蛋白转膜到PVDF膜上。将膜在Mcl-1、cleaved PARP或β-actin一抗稀释液中孵育过夜，之后在带辣根过氧化物酶活性的二抗稀释液中孵育2h，ECL试剂显色曝光，以Mcl-1或cleaved PARP显色条带与β-actin显色条带的灰度比值表示蛋白的相对表达水平。

1.6 质粒构建及转染 将HepG2细胞用Trizol试剂裂解后提取mRNA，用PCR法扩增Mcl-1基因的cDNA全长序列（Gene ID：NM_001197320.1）。引物如下：正向引物：5’-GAGAAGCTTGCCACTTCTCACTT CCGCT-3’，反向引物：5’-TGGAATTCATAATCC TCTTGCCACTTGC-3’（下划线碱基分别为HindⅢ，EcoRI限制性内切酶位点）。将PCR扩增产物通过酶切位点与pcDNA3.1连接后构建成pcDNA3.1-Mcl-1重组真核表达质粒。将HepG2细胞接种在6孔板中，待细胞密度生长到铺满板面约80%时按Lipofectamine 2000操作说明书在HepG2细胞中转染2μg pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒或对照空pcDNA3.1质粒培养24h，之后加40μM的欧前胡素再培养24h，检测细胞增殖抑制率，凋亡水平和cleaved PARP表达水平。

1.7 统计学方法 实验重复3次，应用SPSS13.0统计分析软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，P值计算采用非配对双边t检验以及单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 欧前胡素对人肝癌细胞系HepG2生长的抑制作用 欧前胡素呈剂量和时间依赖性地抑制HepG2细胞的生长，见表1。

2.2 欧前胡素下调HepG2细胞Mcl-1表达并诱导细胞凋亡 欧前胡素呈剂量依赖性诱导HepG2细胞凋亡，见表2。

2.3 外源性Mcl-1表达废除欧前胡素对HepG2细胞的凋亡诱导效应 转染pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒可显著升高Mcl-1的表达（P＜0.05），减弱欧前胡素对HepG2细胞生长的抑制作用和凋亡诱导效应（P＜0.05）。见表3～4。

表1 欧前胡素对HepG2细胞的抑制作用（±s）

表1 欧前胡素对HepG2细胞的抑制作用（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与5μM欧前胡素组比较，△P＜0.05；与10μM欧前胡素组比较，§P＜0.05；与20μM欧前胡素组比较，○P＜0.05；与40μM欧前胡素组比较，□P＜0.05；与同浓度欧前胡素处理24h比较，#P＜0.05

对照组5μM欧前胡素组10μM欧前胡素组20μM欧前胡素组40μM欧前胡素组80μM欧前胡素组333333 051 0 20 40 80 0 2.3±0.55 7.2±1.7* 14.5±2.6*§37.4±3.7*○56.3±4.3*□0 4.8±0.59 14.5±2.1*#△23.6±3.0*#§52.3±4.8*#○78.3±5.9*#□

表2 欧前胡素下调HepG2细胞Mcl-1表达诱导凋亡（±s）

表2 欧前胡素下调HepG2细胞Mcl-1表达诱导凋亡（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与10μM欧前胡素组比较，△P＜0.05；与20μM欧前胡素组比较，#P＜0.05

组别对照组10μM欧前胡素组20μM欧前胡素组40μM欧前胡素组3333 0 10 20 40 0.5±0.2 3.9±0.8* 12.4±1.8*△26.9±2.5*#0 0.04±0.01 0.11±0.03*△0.29±0.06*#1.12±0.16 0.92±0.12* 0.58±0.07*△0.29±0.05*#孔数欧前胡素浓度（μM）凋亡率（%）cleaved PARP/-actin Mcl-1/ -actin

表3 pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒对欧前胡素抗肿瘤效应的影响（±s）

表3 pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒对欧前胡素抗肿瘤效应的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与空pcDNA3.1组比较，#P＜0.05

组别对照组空pcDNA3.1组pcDNA3.1-Mcl-1组孔数pcDNA3.1-Mcl-1质粒（μg） 空pcDNA3.1质粒（μg）333 002 220欧前胡素浓度（μM）0 40 40 Mcl-1/-actin 1.08±0.14 0.32±0.06* 1.34±0.21*#24h抑制率（%）0 36.5±4.1* 10.5±2.7*#

表4 pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒对欧前胡素抗肿瘤效应的影响（±s）

表4 pcDNA3.1-Mcl-1重组质粒对欧前胡素抗肿瘤效应的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与空pcDNA3.1组比较，#P＜0.05

组别对照组空pcDNA3.1组pcDNA3.1-Mcl-1组孔数pcDNA3.1-Mcl-1质粒（μg） 空pcDNA3.1质粒（μg）333 002 220欧前胡素浓度（μM）0 40 40凋亡率（%）0.6±0.2 25.7±2.3* 6.8±1.2*#cleaved PARP/-actin 0 0.31±0.06* 0.07±0.02*#

3 讨论

肿瘤细胞耐药的重要机制是对化疗药物诱导的凋亡效应的抵抗，因此研究肿瘤细胞抵抗凋亡的分子机制并开发新的治疗药物是中晚期肝癌治疗的重要方法。Mcl-1最早在人髓白血病细胞系中被发现，其序列和功能与Bcl-2相似，但Mcl-1的半衰期很短且受多种内源性分子的调控[6]。Mcl-1定位于线粒体外膜，通过与一些促凋亡蛋白如Bim、Bak和NOXA等形成异二聚体使之失活，从而阻断细胞色素C从线粒体中释放，抑制细胞进入凋亡程序[7-8]。近些年研究[9-10]发现，Mcl-1的表达水平和肿瘤细胞存活与化疗药物耐药密切相关，肿瘤细胞Mcl-1的高表达显著降低了它们对化疗药物所致凋亡诱导效应的敏感性。欧前胡素是一种香豆素类化合物，提取于白芷根部，研究发现其有很强的抗肿瘤效应，能诱导人白血病细胞系HL-60的凋亡[11]，与顺铂合用显著杀伤人宫颈癌细胞等[12]。然而欧前胡素诱导人肿瘤细胞凋亡的具体机制至今仍不十分清楚。本研究发现欧前胡素具有显著的体外抗肝肿瘤的生物效应，其机制为诱导肝癌细胞凋亡。欧前胡素还可显著下调HepG2细胞Mcl-1的表达，当转染外源性Mcl-1表达载体后，Mcl-1水平显著上升并且废除了欧前胡素的抗肿瘤效应，由此证明抑制Mcl-1的蛋白表达可能是欧前胡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。欧前胡素呈剂量依赖性诱导HepG2细胞凋亡。PARP（poly ADP-ribose polymerase）是DNA修复酶，是细胞凋亡核心成员天冬氨酸酶（caspase）的切割底物，因此切割型PARP（cleaved PARP）是细胞凋亡的标记蛋白[13]。Mcl-1是肿瘤细胞内高表达的抗凋亡蛋白，其高表达与肿瘤细胞抵抗凋亡和耐药有关[14]。欧前胡素诱导HepG2细胞凋亡的机制可能和下调Mcl-1蛋白水平有关，本组结果显示，欧前胡素有良好的抗肝肿瘤生物活性，为肝癌细胞的促凋亡治疗提供了新的途径和理论依据。

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（收稿：2014-11-08 修回：2014-12-14）

Imperatorin Down-regulates the Expression of M cl-1 Inducing the Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

YU Fanghong1,HUANG Xiaoyan2.1 Clinical Laboratory,Ningbo Municipal Women and Children's Hospital,Ningbo(315031),China;2 Central Laboratory,Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital, Ningbo(315040),China

Objective To investigate the inhibitory effect of imperatorin on human hepatocellular carcinoma cells and the underlying mechanism.M ethods HepG2 cells were treated with 0（control group）,5,10,20,40,and 80 μM imperatorin for 24 or 48 h,then MTT assay was used to detect the proliferation of HepG2 cells.The apoptosis of HepG2 cells and the expression of Mcl-1 was assessed by flow cytometry and western blot in HepG2 cells treated with 10,20,40μM imperatorin for 24 h.The vector of pcDNA-3.1-Mcl-1 was transfected in HepG2 cells before treated with imperatorin,then the proliferation and apoptosis of cells were detected.Results The inhibition rate of proliferation of HepG2 cells treated with 10,20,40,and 80μM imperatorin was as follows：（7.2±1.7）%,（14.5±2.6）%,（37.4±3.7）%,and（56.3±4.3）%for 24h;（14.5±2.1）%,（23.6±3.0）%,（52.3±4.8）%,and（78.3± 5.9）%for 48h,all with significant difference compared with control group（P＜0.05）.The apoptosis rate of 10,20, and 40μM group was（3.9±0.8）%,（12.4±1.8）%,and（26.9±2.5）%,respective,all with significant differences compared with that of control group[（0.5±0.2）%,P＜0.05].Imperatorin treatment significantly decreased the expression of Mcl-1.Transfection of pcDNA-3.1-Mcl-1 inhibited the anti-tumor effect of imperatorin [（6.8±1.2）%vs（25.7± 2.3）%,P＜0.05].Conclusion Imperatorin exerts anti-tumor bio-activity.It may induce apoptosis of HepG2 cells via down-regulating the expression of Mcl-1.

Human hepatocellular carcinoma cell HepG2;Imperatorin;Mcl-1;Apoptosis

1浙江省宁波市妇女儿童医院检验科（宁波 315031）；2浙江省宁波市李惠利医院中心实验室（宁波 315040）

俞方红，Tel：13957819709