氮、磷对缺刻缘绿藻生长、总脂及花生四烯酸积累的影响

罗梦柳,桑 敏,张成武,李爱芬

暨南大学水生生物研究中心热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心,广州 510632

氮、磷对缺刻缘绿藻生长、总脂及花生四烯酸积累的影响

罗梦柳,桑 敏,张成武＊,李爱芬

暨南大学水生生物研究中心热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心,广州 510632

本文以缺刻缘绿藻 (Parietochloris incisa)为实验材料,研究了其在四种不同氮、磷浓度下的生长、总脂(TL)及花生四烯酸(AA)含量的变化,分析测定了低氮和低磷浓度下脂肪酸的组成。结果表明:在BG-11培养基基础上,氮浓度的改变对缺刻缘绿藻的生物量影响不明显,不同氮浓度下的最终生物量均在 2.1 g·L-1左右。在低氮浓度下 TL和AA达到最大,分别为 33.37%(%干重)和 36.63%(%总脂肪酸,TFA),其中AA占藻体干重的 11.56%。不同磷浓度对缺刻缘绿藻的生长有显著影响,最终生物量在 0.90～2.07 g·L-1之间。TL在 8～20 mg·L-1的磷浓度范围内没有明显变化,为 28%左右。TL与氮、磷浓度呈显著负相关关系,且低氮有利于AA的积累。

缺刻缘绿藻;氮浓度;磷浓度;脂肪酸;总脂;花生四烯酸

花生四烯酸 (Arachidonic acid,AA)是前列腺素、血栓烷素和白三烯的前体物质,也是母乳成分之一,具有重要的生物学功能[1,2]。AA的传统来源是动物的肝脏和鱼油,但这些组织中 AA的含量很低,并且有异味,无法满足市场需求。

缺刻缘绿藻 (Parietochloris incisa)是一种单细胞绿藻,属于 Trebouxiophyceae纲,1996年 Watanabe等在日本 Tateyama高山雪地中首次发现并分离报道[3]。研究证实,缺刻缘绿藻含有丰富的 AA,在氮缺乏条件下,AA的含量为细胞干重的 21%,占细胞总脂肪酸(TFA)含量的 60%[4]。缺刻缘绿藻作为AA含量最高的微藻,不仅具有一般微藻生长繁殖速度快,占地面积小易于大规模培养等优点,尤为有利的是细胞中 90%以上的AA以三酰甘油酯形式贮藏,这为分离提供了有利条件,极有希望用于AA的商业化规模生产。近年来,人们对缺刻缘绿藻的研究大多是关于 AA的合成代谢途径[5-7]、细胞分子生物学[8-9]和培养条件[10-11]等方面。其中,氮饥饿和光强对AA积累的影响有较多报道,磷对其影响的报道则很少[6-8,11]。为此,本文以缺刻缘绿藻为材料,主要研究了不同氮磷浓度对缺刻缘绿藻生长, TL和AA积累的影响,以期为AA的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种

缺刻缘绿藻 (Parietochloris incisa),暨南大学水生生物研究中心藻种库保藏。

1.2 培养条件

采用BG-11培养基,取对数生长期的藻细胞,接种于Φ6×60 cm柱状光生物反应器中,初始OD680为 0.2±0.05,补加 0.5%CO2的压缩空气鼓泡培养,培养温度为 23±1℃,荧光灯提供持续光照,光照强度约为 130μmol·m-2·s-1。

1.3 氮磷浓度的设置

以 BG-11培养基中的氮磷浓度为参照,在K2HPO4浓度为 40 mg·L-1的条件下,设置 NaNO3的浓度为 300 mg·L-1、500 mg·L-1、750 mg·L-1和1500 mg·L-1。在 NaNO3浓度为 1500 mg·L-1的条件下,设置 K2HPO4的浓度为 8 mg·L-1、13 mg· L-1、20 mg·L-1和 40 mg·L-1,每个实验浓度设置 3个平行。

1.4 叶绿素 a的测定

叶绿素 a的测定参照文献[12]的方法进行。

1.5 干重的测定

取一定体积的藻液真空抽滤,在 80℃烘箱中烘至恒重,干燥器冷却后称重。

1.6 藻粉的制备

取一定量的藻液,3500 r/min离心,藻体用蒸馏水洗涤再离心,用ALPHR 2-4(德国)冷冻干燥。冻干藻粉放入冰箱(-20℃)保存待用。

1.7 总脂含量的测定

参照 Khozin-Goldberg I[7]的方法进行。准确称取一定量冻干藻粉放入带螺口的玻璃离心管中,加入 2～4 mL二甲基亚砜甲醇溶液,40℃磁力搅拌 10 min,4℃再搅拌抽提 30 min,常温 3500 r/min离心,转移上清到一玻璃瓶中。剩下藻渣再加入乙醚-正己烷混合液 4℃搅拌抽提 1 h,离心并转移上清到上述小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。加入纯水震荡分相,移取有机相用氮气吹至恒重。

1.8 脂肪酸的分析

参照 Cohen Z[13]的方法进行。称取 25 mg冻干藻粉放入带螺口的玻璃离心管中,加入 2 mL 2%的H2SO4无水甲醇:甲苯 (90:10,V/V),同时加入 25 μL 1%的十七烷酸 (C17:0),充氩气后,80℃磁力搅拌 1.5 h,分别加入 1 mL纯水和正己烷,震荡后3500 r/min离心 3 min,将上层有机相转移到一小玻璃瓶用氮气吹干,加入 100μL正己烷密封,放入冰箱保存待测。

样品经气相色谱-质谱联用仪 (型号为 ThermoFinnigan TRACE GC-MS)分析。利用内标标定各脂肪酸出峰时间和顺序,面积归一法计算各组分的相对百分含量。

1.9 数据处理

用 SPSS13.0单因素方差分析 (ANOVA)中的LSD多重比较进行数据差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮、磷浓度对缺刻缘绿藻生长的影响

在磷酸盐浓度一定的条件下,培养基不同氮浓度对缺刻缘绿藻叶绿素 a和干重的影响见图 1(左列)。由图 1可以看出,在 14 d的培养过程中,不同氮浓度下培养液叶绿素 a含量在接种后 6 d没有差别。随培养时间的延长,培养液叶绿素 a的含量与氮浓度呈正相关关系。300 mg·L-1氮浓度实验组到达平台稳定期的时间最短,叶绿素 a的含量明显低于其它三个实验组,最高时仅为 14.79 mg·L-1。其它三个氮浓度实验组到达稳定期的时间随氮浓度的增大而延长,叶绿素 a含量增加,在 NaNO3浓度为 1500 mg·L-1时,叶绿素 a含量最高达到 42.03 mg·L-1。不同氮浓度对缺刻缘绿藻的干重影响不明显。低氮浓度的最终生物量为 2.05 g·L-1,最大干重增加量为 1.98 g·L-1。NaNO3浓度为 1500 mg ·L-1时,干重最大达到 2.4 g·L-1,最大干重增加量为 2.29 g·L-1。

培养基中的硝酸盐浓度不变,在不同磷浓度条件下,缺刻缘绿藻叶绿素 a和干重的变化见图 1(右列)。磷浓度不同,藻液的叶绿素 a含量在接种后 2天内没有差别。磷浓度在 8～20 mg·L-1范围内,藻液叶绿素 a的含量差别不明显,随培养基中磷浓度的进一步提高,叶绿素 a含量迅速增大,当 K2HPO4浓度为 40 mg·L-1时,叶绿素 a含量达到最高,为30.11 mg·L-1,比低磷实验组增加了 83.18%。缺刻缘绿藻的生物量与培养液的磷浓度呈正相关,随磷浓度的增加,最终干重分别为 0.9 g·L-1、1.38 g ·L-1、1.64 g·L-1和 2.07 g·L-1。最大干重增加量分别为 0.83 g·L-1、1.30 g·L-1、1.52 g·L-1和 1.96 g·L-1。以上结果说明磷限制对生物量的影响比氮限制更为明显。

图 1 缺刻缘绿藻在不同氮浓度(左列)和磷浓度下(右列)的叶绿素 a(上排)和干重(下排)Fig.1 Chl.a content(up)and dryweight(down)ofParietochloris incisacultures under the different nitrogen(left)and phosphorus concentration(right)

2.2 不同氮、磷浓度对缺刻缘绿藻总脂含量的影响

图 2 缺刻缘绿藻在不同氮浓度(左列)和磷浓度下(右列)的总脂含量(上排)和单位体积总脂产量(下排)Fig.2 Total lipids(up)and volumetric productivityof total lipids(down)inParietochloris incisacultures after 14 days under the different nitrogen(left)and phosphorus concentration(right)

图 2是缺刻缘绿藻在不同氮磷浓度下的总脂(TL)含量和单位体积总脂产量。从图中可以看出,不同氮磷浓度实验组的 TL含量都随着培养时间的延长而增加,各实验组在培养前期 TL增加不明显,从稳定期开始 TL明显增加。TL含量与氮磷浓度呈负相关,且氮浓度的影响更显著,能获得更高的 TL。四个不同氮浓度实验组 TL的最终含量分别为33.37%,29.63%,21.75%和 20.89%,最大总脂收获量分别为 0.69 g·L-1,0.65 g·L-1,0.49 g·L-1和0.5 g·L-1。从图中还可以看出,在一定的较低氮浓度范围内,TL的含量接近,NaNO3的浓度在 300～750 mg·L-1时,TL的含量都较高。这个结果说明低氮浓度有利于 TL的积累。在氮浓度固定磷浓度不同的条件下,不同实验组 TL的最终含量分别为29.57%,28.48%,26.5%和 18.91%,最大总脂收获量分别为 0.27 g·L-1、0.39 g·L-1、0.43 g·L-1和0.39 g·L-1。K2HPO4浓度为 40 mg·L-1实验组的TL最低,其它三个实验组的 TL含量接近,都可以获得较高的 TL。缺刻缘绿藻的单位体积总脂产量在低磷浓度时最低,为 25.42 mg·L-1。这是由于藻细胞生长受到磷的限制,生物量很低,虽然可获得较高的 TL,但最终单位体积总脂产量较低。而在 300 mg ·L-1低氮浓度下,获得缺刻缘绿藻的单位体积总脂产量最高,为 67.14 mg·L-1。

2.3 不同氮、磷浓度对缺刻缘绿藻花生四烯酸含量的影响

实验分析了BG-11培养基浓度和低氮、低磷条件下缺刻缘绿藻藻粉的主要脂肪酸组成,结果见表1。由表 1可知,缺刻缘绿藻含有多种脂肪酸,除软脂酸 (16∶0)和硬脂酸 (18∶0)等饱和脂肪酸的含量较高外,还有其它多不饱和脂肪酸,其中不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸 (TFA)的 81%。不饱和脂肪酸中花生四烯酸 (20∶4ω6)含量最高,其次是油酸(18∶1)。在低氮条件下,缺刻缘绿藻的 AA含量最高,占 TFA的 36.63%,藻粉中 AA含量可达干重的11.56%,远远高于BG-11培养基氮浓度下的 4.01% (见图3)。低磷浓度下AA分别占 TFA和藻体干重的15.2%和 4.43%,明显低于BG-11培养基磷浓度下的23.54%和4.01%,也低于油酸的含量 31.34%,这说明低磷条件下大部分油酸还未转化为AA。

表 1 缺刻缘绿藻在不同氮磷浓度下的脂肪酸组成和含量Table 1 Fatty acids composition of lipids ofParietochloris incisaat different concentration of nitrogen and phosphorus

图 3 缺刻缘绿藻在不同氮浓度(左)和磷浓度下(右)的花生四烯酸含量Fig.3 Production of arachidonic acid(AA)contentofParietochloris incisaunder the different nitrogen(left)and phosphorus concentration(right)

3 讨论

氮和磷是微藻生长的重要营养因子,是维持细胞生长必需的。在氮缺乏状态下,微藻光合作用会受到影响,体内蛋白质合成停止并导致细胞分裂减缓,生长速率下降[14]。本实验中氮浓度对缺刻缘绿藻叶绿素 a含量的影响明显,且与氮浓度呈正相关。但不同氮浓度下的最终生物量干重差别不明显,说明实验的最低氮浓度 300 mg·L-1没有限制藻细胞的生长。微藻在缺氮时同化产物多转化为糖类或脂类物质,通常会增加饱和脂肪酸的含量。梁英[15]的研究表明三角褐指藻在处于氮饥饿状态下,PUFA和 EPA的含量下降。而本实验在低氮浓度下缺刻缘绿藻的总脂含量和花生四烯酸含量分别为 33.37%和 36.63%,比正常氮浓度下增加了 59.7%和55.6%。缺刻缘绿藻的不饱和脂肪酸占 TFA的81%左右,这个结果与刘建国等[11]的测定结果一致。在低氮浓度下,缺刻缘绿藻 AA占 TFA的36.63%,这与Bigogno C等的报道相近,但花生四烯酸的含量却明显低于文献报道的 60%的水平[4]。究其原因主要是光照强度和氮浓度的影响,光照强度的提高和氮饥饿又有利于AA的积累[11]。

培养基中的磷是藻类合成叶绿素所必需的,同时参与碳水化合物的代谢及脂肪酸的转化。本实验在低磷浓度下,接种 3 d后出现明显的磷限制现象,随着培养时间的延长,不同磷浓度实验组的叶绿素a,干重,总脂的差距越来越显著。这是由于随着培养时间的延长,培养液中的磷逐渐被消耗,而在培养的前几天,微藻可以储存,在细胞质中形成多聚磷颗粒[15],在磷缺乏时,保持磷元素的供应。低磷浓度限制了缺刻缘绿藻的生长,但却有利于总脂的提高。

4 结论

氮和磷限制都有利于缺刻缘绿藻总脂的积累,且氮限制明显。在低氮条件下可获得较高的花生四烯酸含量,低磷浓度不利于缺刻缘绿藻花生四烯酸的积累。

1 Khozin-Goldberg I,Cohen Z,Pimenta-Leibowitz M,et al. Feeding with arachidonic acid-rich triacylglycerols from the microalgaParietochloris incisaimproved recovery of guppies from infection with Tetrahymena sp.Aquacultrue,2006,255: 142-150.

2 Koletzko B,Schmidt E,Bremer HJ,et al.Effects of dietary long-chain polyunsaturated fatty acids on the essential fatty acid status of premature infants.J Pediatr,1989,148:669-675.

3 Watanabe S,Hirabashi S,Boussiba S,et al.Parietochloris incisacomb.Nov(Trebouxiophyceae Chlorophyta).J Phycol Res,1996,44:107-108.

4 Bigogno C,Khozin-Goldberg I,Boussiba S,et al.Lipid and fatty acid composition of the green oleaginous algaParietochloris incisa,the richest plant source of arachidonic acid.Phytochem istry,2002,60:497-503.

5 Bigogno C,Khozin-Goldberg I,Cohen Z.Accumulation of arachidonic acid-rich triacylglycerols in the microalgaParietochloris incisa(Trebuxiophyceae,chlorophyta).J Phytochem istry,2002,60:135-143.

6 Zhang CW(张成武),Cohen Z,Khozin-Golgberg I,et al. Characterization of growth and arachidonic acid production ofParietochloris incisacomb.nov.(Trebouxiophyceae,Chlorophyta).J Appl Phycol,2002,14:453-460.

7 Khozin-Goldberg I,Shrestha P,Cohen Z.Mobilization of arachidonyl moieties from triacylglycerols into chloroplastic lipids following recovery from nitrogen starvation of the microalgaParietochloris incisa.J B iochem etB iophy Acta,2005, 1738:63-71.

8 Merzlyak MN,Chivkunova OB,Gorelova OA,et al.Effect of nitrogen starvation on optical properties,pigments,and arachidonic acid content of the unicellular green algaParietochloris incisa(Trebouxiophyceae,Chlorophyta).J Phycol, 2007,43:833-843.

9 Liu SC(刘士成),Du DH(杜道海),Zhang CW(张成武),et al.Construction of cDNA library of a green microalgaMyrmecia incisa.J SH Ocean U(上海海洋大学学报),2008,5: 535-538.

10 Liu JG(刘建国),Zhang CW(张成武),Cohen Z,et al. Physiological inhibitory effect of OCS in arachidonic acidrichParietochloris incisa(Trebouxiophyceae,Chlorophyta).Chin J Ocean Lim nol,2002,20:248-255.

11 Liu JG(刘建国),LiuW(刘伟),Cohen Z.The high producitivy of biomass and arachidonic acid in continuous high density culture ofParietochloris incisa.Chin J Ocean Limnol(海洋与湖沼),2002,33:499-508.

12 Lichtenthaler HK.Chlorophylls and Carotenoids:Pigments of Photosynthetic Biomembranes.M eth Enzym,1987,147:350-382.

13 Cohen Z,Nor man HA,Heimer Y M.Potential use of substituted pyridazinones for selecting polyunsaturated fatty acid overproduing cell lines of algae.Phytochem itry,1993,32: 259-264.

14 Jin Y M(金月梅).Effects of nitrogen and phosphorus limitation on the hlorophyll fluorescence and growth of eight microalga strains.Qingdao:OUC (中国海洋大学 ),PhD. 2008.

15 Liang Y(梁英),Mai KS(麦康森),Sun SC(孙世春),et al. Effect ofNaNO3concentrations on the growth and fatty acid compositions ofPhaeodactylumtricornutumMACC/B226.M arine Sci(海洋科学),2002,26:48-51.

Effects of Nitrogen and Phosphorus on the Growth,Total Fatty Acids and Arachidon ic Acid Production ofParietochloris incisa

LUO Meng-liu,SANGMin,ZHANG Cheng-wu＊,L IAi-fen
Institute of Hydrobiology,Jinan University,Engineering Research Center of Tropical and SubtropicalAquatic Ecological Engineering,M inistry of Education,Guangzhou 510632,China

The green freshwatermicroalgaParietochloris incisais known as the richest plant source ofAA.The effects of nitrogen and phosphorus concentrations on the growth,total lipids(TL)and arachidonic acid(AA)content inP.incisawere studied.The results showed that nitrogen concentrations has no obvious influence on the growth ofP.incisaand the final biomass stable at 2.1 g·L-1under different nitrogen concentrationswhen phosphorus concentration fixed.The TL reached maximum to 33.37%of dryweight,and the proportion of AA comprising 36.63%of total fatty acids(TFA) and 11.56%of dryweight under low nitrogen concentration.When nitrogen concentration is fixed,phosphorus concentration has significant influence on the growth ofP.incisa.The final biomass ranged from 0.90 to 2.07 g·L-1.TL achieved about 28%when the phosphorus concentrations increased from 8 to 20 mg·L-1.It is demonstrated by the statistical analysis that the TL contents negatively correlated to nitrogen and phosphorus concentration.

Parietochloris incisa;Nitrogen concentration;Phosphorus concentration;Fatty acids;Total lipids;Arachidonic acid.

Q949.21;Q17

A

1001-6880(2010)03-0378-05

2010-03-15 接受日期:2010-05-21

国家“863”计划重点项目 (2009AA064401);珠海市科技局项目(PC20081008)

＊通讯作者 Tel:86-20-85222025;E-mail:tzhangcw@jnu.edu.cn