温、光、盐对硅藻STR01生长、总脂、脂肪酸的影响

薛瑞萍 蒋霞敏 韩庆喜 张聪颖

(宁波大学海洋学院, 宁波 315211)

微藻在水产养殖中的作用越来越重要, 不但可以作为饵料生物, 提高水产动物幼体的成活率[1]; 而且可以调节水质, 消除氮磷, 抑制病害发生[2]。温度、盐度、光照是影响海洋微藻生长和代谢的重要生态因子, 直接影响细胞内的光合电子传递、代谢途径调控、特异性酶反应和细胞的通透性等, 是影响藻细胞生长、油脂积累和脂肪酸组成的重要因素。大量研究表明改变微藻的培养条件和培养周期, 不但会影响微藻生长速率, 还会影响海洋微藻的油脂含量以及脂肪酸组成, 特别是PUFA、EPA和DHA的含量, 而且两者往往不同步, 所以很多学者提出“分级培养”或“二次培养”[3—6]。

STR01是一种扭鞘藻(Streptothecasp.), 是本实验室从象山港海区新分离的一株生长快、不易老化和污染、耐高温的浮游硅藻。该藻隶属于硅藻门、中心纲、盒形硅藻目、真弯藻科、扭鞘藻属。该藻壳面呈椭圆形, 壳环面长方形, 壳长22—38 μm,壳宽12—19 μm, 色素体黄褐色片状。初步试验表明是一种理想的贝类育苗饵料。但有关该藻的生态习性及培养方法迄今为止未见报道。为此, 本文通过单因子和正交试验进行了温度、盐度、光照强度对该藻的生长、总脂和脂肪酸组成影响的研究,以期为扭鞘藻的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养

STR01藻种保藏于宁波大学饵料生物培养室,实验药品均为分析纯; 培养用水为象山港海域天然海水, 经沙滤、暗沉淀、脱脂棉过滤、烧开, 凉冷后使用; 培养液采用宁波大学#3母液配方[4]。藻种置于GXZ智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂)中活化和扩大, 培养静置不充气, 每天定时摇藻 2 次, 早晚各1次。培养条件: 温度 (25±1)℃, 光照 60 μmol/(m2·s), 光暗周期(L∶D) 12∶12。

1.2 实验方法

温度试验设置温度梯度10、15、20、25、30和35℃, 培养容器为消毒的1000 mL三角烧瓶, 各6平行。每瓶加培养液900 mL(宁波大学3#培养液配方), 接种100 mL, 其他培养条件: 光照强度60 μmol/(m2·s), 光周期(L∶D) 12∶12, 盐度25, pH 8.10, 所有试验瓶均放在GXZ智能型光照培养箱,培养时间7d。接种后计数N0, 7d后计数Nt, 采用离心机(Centrifuge 5430 R)藻液离心(6000 r/min)收集藻, 存放并冷冻干燥(-80℃, FD5-3T, Gold-SIM), 测定总脂和脂肪酸。

光照强度试验设置光照强度梯度40、60、80、100和120 μmol/(m2·s), 各6平行。培养条件: 温度25℃, 光周期(L∶D) 12∶12, 盐度25, pH 8.1,其他条件同上。

盐度试验盐度梯度设置为10、15、20、25、30和35, 各6平行。培养条件: 光照强度60 μmol/(m2·s), 光周期(L∶D) 12∶12, 温度25℃, pH 8.1。其他条件同上。

温、光、盐正交试验本试验采用温度(A)、光照强度(B)和盐度(C)三因素三水平正交试验(表1), 其他培养条件: 光周期(L∶D) 12∶12, pH 8.1, 其他条件同上。

表1 正交试验参数因数水平表Tab. 1 The orthogonal test parameter-factor level

1.3 总脂含量及脂肪酸的测定

总脂的抽取及测定采用改良Bligh-Dyer方法[7, 8]。取一定体积藻液, 6000 r/min离心10min, 再用消毒淡水清洗2—3次, 冷冻干燥保存(FD5-3T,Gold-SIM)。将干燥的藻泥用研钵研碎后, 采用氯仿∶甲醇提取法, 得出总脂含量。

脂肪酸组成分析采用KOH甲醇水法[9,10]。总脂用5%—6%KOH-甲醇∶水(体积比为4∶1)皂化2h(60℃水浴), 2 mL氯仿: 正己烷(体积比1∶4)提取;后甲酯化, 旋转蒸发蒸用正己烷(色谱纯)到离心管中离心, 取上清液, 再进行GL-MS分析。用6890N/5973气相色谱-质谱联用仪按照面积归一化法计算各组分的相对百分含量。

1.4 统计与数据处理

平均相对生长速率计算公式为:K=(lnNtlnN0) /t(式中,N0为初始细胞数目、Nt为培养7d后的细胞数、t为培养时间)。得出的实验数据用平均值(Mean)±标准差(SD)表示, 单因素方差分析(ANOVA)和多元方差分析(MANOVA)以及Duncan多重比较分析(α=0.05)均用SPSS 17.0 统计软件, 用2007版Excel进行图表制作。

2 结果

2.1 温度对STR01的生长、总脂含量及脂肪酸的影响

温度对STR01生长和总脂含量的影响不同温度对STR01的平均相对生长速率影响显著(P＜0.05)。该藻在15—35℃内, 随着温度升高平均相对生长速率呈先上升后降低趋势, 在30℃时该藻的平均相对生长速率最大(K值为0.682), 但25℃组与30℃组平均相对生长速率差异不显著(P＞0.05), 温度在10℃条件下, 培养7d大部分藻死亡分解, 藻液颜色变白。所以该藻适合的温度是15—35℃, 最适温度为25—30℃(图1)。

图1 温度对STR01生长和总脂含量的影响Fig. 1 Effects of temperature on growth and total lipid content of STR01

在温度10—35℃内, 温度10℃时, 由于藻体死亡分解, 无法收集, 量不足无法完成总脂含量的测定。在15—35℃的温度下, 温度对该藻的总脂含量有影响显著(P＜0.05), 随着温度升高, 该藻总脂含量先增加后减少, 其中25℃时总脂含量最高(17.23%),且显著高于其他组(P＜0.05)(表2)。

温度对STR01脂肪酸组成和含量的影响本试验共测定出该藻含13种主要脂肪酸, 其中饱和脂肪酸(SFA) 4种, 单不饱和脂肪酸(MUFA) 2种, 多不饱和脂肪酸(PUFA) 7种。主要脂肪酸为C14∶0、C16∶1、 C16∶0、 C18∶0和C20∶4 (n-6)。试验结果表明, 温度对该藻PUFA、EPA含量影响显著(P＜0.05), 在温度15—30℃内, 该藻PUFA的含量随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势, PUFA的含量为19.01%—34.23%, 30℃时PUFA的含量最高(34.23%)。该藻的EPA和DHA含量极少, 在15—35℃条件下EPA含量为0.11%—1.11%, DHA含量为0.07%—2.16%。

表2 温度对STR01的脂肪酸组成和含量的影响(%)Tab. 2 Effects of temperature on fatty acid composition and content in STR01 (%)

2.2 光照强度对STR01的生长、总脂含量及脂肪酸的影响

光照强度对STR01生长和总脂含量的影响不同的光照强度对STR01的平均相对生长速率影响显著(P＜0.05)。该藻在40—120 μmol/(m2·s), 随着光照强度的升高生长速率呈先上升后降低趋势,60 μmol/(m2·s)时平均相对生长速率最大(K值0.630), 且显著高于其他组。该藻生长的适合的光照强度是40—120 μmol/(m2·s), 最适光强为60 μmol/(m2·s)。

光照强度在60 μmol/(m2·s)时该藻的总脂含量显著高于较其他组(P＜0.05), 此时含量最高(16.73%)。总脂含量按照从高到低的排序60 μmol/(m2·s)(16.73%)＞40 μmol/(m2·s)(13.07%)≥100 μmol/(m2·s)(9.37%)＞80 μmol/(m2·s)(6.87%)＞120 μmol/(m2·s)(6.67%)(图2)。

图2 光照强度对STR01生长和总脂含量的影响Fig. 2 Effects of light intensity on growth and total lipid content of STR01

光照强度对STR01脂肪酸组成和含量的影响由表3所示, 不同光照强度对该藻PUFA影响显著(P＜ 0.05), 低光照[40 μmol/(m2·s)]时PUFA含量最高(34.29%)。PUFA中主要是C20∶4 (n-6)的含量,光照[80 μmol/(m2·s)]时达18.20%。该藻的EPA和DHA含量不高, 各组差异显著(P＜ 0.05)。光照强度为20 μmol/(m2·s)该藻EPA最高(2.88%), 光照强度为80 μmol/(m2·s)该藻DHA最高(2.23%)。

2.3 盐度对STR01的生长、总脂含量及脂肪酸的影响

盐度对STR01生长的影响不同的盐度对STR01的平均相对生长速率影响显著(P＜0.05)。在盐度10—35, 随着盐度的升高STR01平均相对生长速率呈先上升后降低趋势, 盐度25时平均相对生长速率最高(K为0.634), 盐度为10时扭鞘藻的数量几乎没有增加(图3)。该藻生长的适合盐度范围是10—35, 最适盐度为25。

盐度对STR01的总脂含量影响显著(P＜ 0.05)。在盐度10—35, 随着盐度的升高, 该藻总脂含量呈先增加后减少趋势, 盐度30时最高(13.66%), 且显著高于其他组(图3)。

图3 盐度对STR01生长和总脂含量的影响Fig. 3 Effects of salinity on growth and total lipid content of STR01

表3 光照强度对STR01的脂肪酸组成和含量的影响Tab. 3 Effects of light intensity on fatty acid composition and content in STR01 (%)

盐度对STR01脂肪酸组成和含量的影响盐度对STR01的脂肪酸组成及含量影响显著(P＜ 0.05)。盐度10—35 时PUFA的含量随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势, 盐度25时PUFA的含量最高(43.42%)。PUFA中主要是C20∶4 (n-6)的含量, 盐度25时达27.20%。在盐度10—35 条件下EPA含量为1.06%—9.80%, DHA含量为1.92%—2.66%。在盐度25、30、35时EPA含量大幅度增加, 分别达9.80%、9.16%和7.25%, 特别是盐度25时, EPA含量高达9.80%(表4)。

2.4 温光盐正交试验对STR01生长、总脂及脂肪酸的影响

温光盐正交试验对STR01生长和总脂的影响采用温度(A)、光照强度(B)、盐度(C)进行正交试验, 结果藻细胞生长和总脂含量见表5。生长最优组合为: A3B2C2, 即温度30℃、光照强度60 μmol/(m2·s)、盐度25, 该组合时平均相对生长速率最大(K值达0.756); 总脂含量积累的最优组合为A3B2C1即温度30℃、光照强度60μmol/(m2·s)、盐度20, 总脂含量可达20.00%。

影响STR01生长的正交因素主次为A＞C＞B,3因素中温度对STR01平均相对生长速率影响最大(表6), 在置信区间95%的情况下, 得出3个因素对平均相对生长速率影响的显著性排序为FA＞FC＞FB,即温、光、盐对该藻平均相对生长速率的可靠性影响的大小顺序为A＞C＞B, 与方差分析的结果一致(表7)。温度和盐度对该藻生长速率的影响有高度显著差异(P=0.000); 光照强度对STR01平均相对生长速率有显著差异(P=0.012); 温度和盐度有交互作用, 且交互作用极度显著(P=0.000); 温度、光照强度和盐度这三者的交互作用显著(P=0.001)。

表4 盐度对STR01的脂肪酸组成和含量的影响Tab. 4 Effects of salinity on fatty acid composition and content in STR01 (%)

表5 STR01生长速率和总脂正交试验设计Tab. 5 Orthogonal test design of the relative growth ratio and total lipid combination of STR01

同样影响STR01总脂正交因素主次为B＞A＞C,即光照强度对总脂含量的影响最大(表8、表9)。温度和光照强度对该藻总脂含量影响高度显著(P=0.000), 盐度对该藻总脂含量影响有显著差异(P=0.002)。温度和光照、光照和盐度之间有交互作用(P=0.000); 温、光、盐三者有交互作用(P=0.000)。

温光盐正交试验对STR01脂肪酸组成和含量的影响在试验设定的组合下, PUFA含量最高时的组合为A2B2C1(温度25℃、光照强度60 μmol/(m2·s)、盐度20), 此时PUFA含量为35.37%, 该组合与组合为A2B3C1(温度25℃、光照强度80 μmol/(m2·s)、盐度20)无显著性差异。PUFA中主要是C20∶4 (n-6)的含量, 组合为A2B2C1(温度25℃、光照强度 60 μmol/(m2·s)、盐度20)时C20∶4 (n-6)的含量最高为23.80%, 组合为A3B2C1(温度30℃、光照强度60 μmol/(m2·s)、盐度20)时含量最高为21.90%。该藻的EPA和DHA含量虽然极少, 但在A3B2C1(温度30℃、光照强度60 μmol/(m2·s)、盐度20)条件下该藻的EPA含量达到最高(2.91%)A2B2C1 (温度25℃、光照强度60 μmol/(m2·s)、盐度20)条件下该藻的DHA含量达到最高(2.56%)(表10)。

表6 生长速率极差分析Tab. 6 Range analyses of relative growth ratio

表7 生长速率方差分析Tab. 7 ANOVA of the relative growth ratio

表8 总脂含量极差分析Tab. 8 Range analyses of total lipid content

表10 正交试验对扭鞘藻的脂肪酸组成和含量的影响Tab. 10 Effect of orthogonal test on fatty acid composition and content in STR01 (%)

续表10

3 讨论

3.1 温度对微藻的影响

温度是影响微藻生长和代谢的重要环境因子之一[11]。温度对海洋微藻的生长及发育等具有调节作用, 对营养物的吸收利用效率、酶的活性、及细胞分裂的周期等存在不同程度不同方式的影响[12]。正交试验结果表明, 温度对STR01平均相对生长速率影响最大, 单因子试验表明: STR01生长的适温为15—35℃, 最适温度25—30℃ (0.679—0.682)。该藻在15—35℃内, 随着温度升高平均相对生长速率呈先上升后降低趋势, 在30℃时该藻的平均相对生长速率最大(K值为0.682), 但25℃组与30℃组平均相对生长速率差异不显著(P＞ 0.05), 温度在10℃条件下, 培养7d大部分藻死亡分解, 藻液颜色变白。这一结果与金德祥等[13]研究扭鞘藻对温度的适应范围是在10—30℃, 最适温度是在20—25℃的试验结果不一致, 可能由于其试验环境、条件和藻种不同所致。不同海洋微藻对不同的温度的适应能力不同, 海链藻(Thalassiossirasp.)在温度24—27℃时, 其生长则明显受到抑制, 在30℃时则完全不能生长, 但在18—24℃温度范围内,海链藻具有较高的生长速率[14], 而牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)是一种耐高温藻种, 其生长的最佳温度为25—35℃。本试验STR01在10℃以下完全不能生长, 在35℃时平均相对生长速率明显降低。

有研究表明, 在极端低温或高温情况下, 微藻合成油脂的含量减少[15—17], STR01在低温15℃和高温35℃时总脂积累很少, 总脂含量也相差不大, 低温和高温对微藻的危害方式并不相同。Opute[16]认为海洋微藻的油脂合成, 在极端温度下微藻的油脂合成受限, 可能是由于合成脂肪相关的酶发生不可逆损伤。低温对微藻的破坏是机械性, 而高温对微藻的破坏是化学性, 大量的研究表明微藻对低温的抵抗和忍耐性较强。不同藻种总脂含量积累的最适温度不同, 本试验总脂含量积累的最适温度是25℃(总脂含量可达17.23%)。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的诱变株MP-2, 总脂积累的最适温度是20℃[18]。硅藻的脂肪酸主要成分有C14∶0、C16∶1 (n-7)、C16∶0, 有些硅藻的富含EPA。扭鞘藻属于硅藻, 本试验表明其主要脂肪酸成分是C14∶0、C16∶1、C16∶0、C18∶0和C20∶4 (n-6), 其EPA含量不高。有研究表明海链藻低温处理可明显提高长链多不饱和脂肪酸含量, 但并不是其积累PUFAs的最佳温度[11]。在本试验的单因子试验中,温度20℃下, PUFA含量最高达34.23%, 在正交试验中, 温度为25℃时, PUFA积累较多, 而30℃该藻平均相对生长速率最高, 若要获得较多的不饱和脂肪酸可考虑分步培养。

3.2 光照强度对微藻的影响

光照影响微藻的生长速率和光合作用, 对细胞体内生化成分产生影响, 光强和照射时间的长短影响微藻光合作用的效率[14,19]。光是影响海洋微藻生化成分种类和含量多少及其生长的最重要的因子之一, 有研究实验结果表明超过一定的光照强度范围, 微藻生长会受到抑制。本次试验光照强度为60 μmol/(m2·s)时, STR01平均相对生长速率K值达到最大(0.630), 当光照强度超过100 μmol/(m2·s)时,STR01的平均相对生长速率明显降低, 说明高光强不利于该藻的生长。不同的藻种的生长适应的光强不一样, 如后棘藻(Ellipsoidionsp.)在光强较高下生长速率高, 其适宜光强范围为108.75—244.15 μmol/(m2·s), 光强低于71.12 μmol/(m2·s)时生长速率有所降低[20]。多方面的研究显示, 浮游海洋微藻在变化的环境中生存和生长的, 其生理适应是关键过程,水生浮游植物为了提高其不同环境中生存能力, 可以通过提高对环境因子的适应能力来实现, 特别是在资源能够循环再生的情况下, 这种调节机制更加的明显[21]。

正交试验结果表明, 光照强度对STR01总脂含量的积累影响最大, 单因子试验表明光照强度为60 μmol/(m2·s)时, STR01的总脂含量最高可达16.73%。单因子试验结果表明, 随着光照强度的升高, 总脂含量呈下降趋势, 表明高光不利于STR01总脂的积累。国内学者对微绿球藻[22]、后棘藻[19]、小球藻和三角褐指藻[23]的研究中也发现PUFA含量随光强增加而呈下降趋势。低光下两种藻小新月菱形藻和等鞭金藻的脂肪含量多, 而高光下则相反[23]。低光照[20 μmol/(m2·s)]更有利于2 株曼氏骨条藻(Skeletonema munzelii)总脂及PUFA的积累[22],单因子光照强度试验和正交试验都结果表明光强[60 μmol/(m2·s)]有利于STR01的PUFA的积累, 单因子试验结果表明, 随着光照强度的升高, PUFA呈下降趋势, 表明高光不利于STR01PUFA的积累。

3.3 盐度对微藻的影响

本试验结果表明, 适合STR01生长的盐度为15—35, 最适生长盐度为25(K值0.634)。盐度影响藻类的渗透压和营养盐的吸收。当微藻生活的盐度环境发生改变时, 细胞的渗透压受到影响也随之改变, 过低或过高的盐度均会对微藻造成伤害[24,25]。盐度在 10 以下, STR01几乎完全不能生长, 在盐度15—35 时,K值呈现先上升后下降趋势。藻种不同,对盐度的适应力也不同, 亚历山大藻(Alexandriumsp.)偏嗜较高盐度环境, 在低盐度下几乎不能生长。蛋白核小球藻适盐范围比较广, 在盐度15—45范围内均可以快速生长。

不同藻种的在不同的盐度下, 总脂含量的积累也不同, 本试验STR01总脂含量积累的适宜盐度范围是10—35, 盐度30时, 总脂含量最高(13.66%)。有研究表明高盐有利于总脂的积累, 虽然高盐下微藻的生长率不高。在高盐度下微藻的生长需要更多能量, 藻细胞内的储存的脂肪的含量相应增加[26,27]。