团头鲂nanos3基因的克隆鉴定

朱 林 王厚鹏 朱作言 孙永华 叶 鼎

(1. 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉 430072;2. 中国科学院大学现代农业科学学院，武汉 430072)

Nanos通常被认为对生殖细胞的存活和全能性的维持起重要作用。动物中一般存在1—4个nanos基因[1]。该基因编码高度保守的RNA结合蛋白。该蛋白C端拥有2个连续的半胱氨酸-半胱氨酸-组氨酸-半胱氨酸(Cys-Cys-His-Cys, CCHC)锌指基序[2,3]。

Nanos基因在非脊椎动物和脊椎动物中均得到了鉴定和研究。果蝇(Drosophila melanogaster)中只有1个nanos基因, 该基因在介导腹部形成、原始生殖细胞(Primordial Germ Cells, PGCs)特化和迁移以及生殖干细胞的维持等方面发挥重要作用[4,5]。在小鼠(Mus musculus)中,nanos2和nanos3在PGCs和未分化的精原细胞中表达,nanos2突变导致雄性精原细胞的缺失, 而nanos3突变导致精巢和卵巢中的生殖细胞均缺失[6]。在硬骨鱼类中, 斑马鱼(Danio rerio)nanos有3个基因:nanos1、nanos2、nanos3。Nanos1在成熟卵巢的早期卵母细胞中有表达;nanos2在成鱼精卵巢的生殖干细胞中表达, 对于维持生殖干细胞必不可少[7,8];nanos3在生殖质和PGCs中特异性表达[9], 对PGCs的形成和迁移以及卵母细胞的产生及维持至关重要[7,9]。

在鱼类中,nanos3的3′UTR常被用于介导荧光蛋白在PGCs中特异性表达, 用于PGCs的活体标记[10]。利用胚胎注射EGFP-nanos3′UTR mRNA的方法, 在斑马鱼[10]、鲤(Cyprinus carpio)[11]、青鳉(Oryzias latipe)[12]、日本鳗鲡(Anguilla japonica)[13]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[14]中实现了PGCs的可视化标记。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)属鲤形目,鲤科, 鲂属, 又名武昌鱼。其具有养殖成本低、生长迅速、食性广、养殖成活率高、肉质鲜美等特点, 是我国重要的经济鱼类之一[15]。为了开展团头鲂原始生殖细胞操作相关的研究, 我们克隆和分析了团头鲂的nanos3基因, 并利用该基因的3′UTR序列进行特异性标记PGCs实验。我们发现, 和斑马鱼nanos3的3′UTR相比, 利用团头鲂自身的nanos3-3′UTR能够更加特异地标记团头鲂的PGCs。这项研究工作为将来开展基于团头鲂PGCs的遗传操作提供便利。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用雌、雄团头鲂均养殖于中国科学院水生生物研究所官桥水产养殖基地, 在繁殖季节采用人工授精的方法获取团头鲂的胚胎, 置于(22±1)℃的环境发育。成体组织取自2龄的团头鲂。AB品系的斑马鱼均来自于国家斑马鱼资源中心(武汉, http://zfish.cn)。斑马鱼饲养于14h∶10h光暗周期及28.5℃恒温条件下。用于显微注射的胚胎由雌、雄斑马鱼自然产卵而得。

1.2 方法

总RNA的提取获取团头鲂不同发育时期胚胎及幼鱼和成体不同组织, 采用Trizol (Invitrogen)法提取胚胎、幼鱼及成鱼各组织的总RNA, 用超微量分光光度计(Thermo, NanoDrop 2000)和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度及纯度, 将RNA溶于无核酸酶水中, 置于-80℃冰箱中保存备用。

团头鲂nanos3基因全长cDNA的克隆根据斑马鱼和鲤鱼nanos3基因的序列比对, 在保守功能域设计引物nanos-F和nanos-R (表1)。以团头鲂卵巢组织总RNA为模板, 根据Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific)说明书反转录获得cDNA。以此cDNA为模板进行PCR扩增, 获得团头鲂nanos3基因的中间片段。根据获得的中间片段, 设计RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)扩增引物(表1)。3′RACE和5′RACE利用System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒(Thermo Fisher Scientific)并按照说明书进行。

扩增的PCR产物经DNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化回收DNA后连接至pMD18-T(TaKaRa), 经转化、挑克隆和测序(武汉天一辉远生物科技有限公司), 获得相应片段的阳性克隆。所获得的片段序列经Lasergene软件拼接分析获得团头鲂nanos3基因全长cDNA序列。

表1 团头鲂nanos3基因cDNA全长的克隆及表达所用到的引物Tab. 1 Primers used for nanos3 full length cDNA cloning and expression

nanos3基因氨基酸序列比对及系统进化分析使用Lasergene软件预测团头鲂nanos3基因编码的氨基酸序列, 采用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Clustal W (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)将预测的氨基酸序列与NCBI的其他物种Nanos3进行蛋白质序列比对。同时, 基于各个物种Nanos3蛋白序列, 使用MEGA5.1软件构建NJ (Neighbor-joining方法)系统发育树[16]。所用到各物种的氨基酸序列GenBank登录号如下: 团头鲂(M. amblycephala): MH215557; 金线鲃(Sinocyclocheilus grahami): XP_016139847; 鲤(C. carpio): XP_018955255;银鲫(Carassius gibelio): AKP99418; 斑马鱼(D. rerio):NP_571953; 大西洋鲑(Salmo salar); XP_013985774;虹鳟(Oncorhynchus mykiss): NP_001268351; 青鳉(O. latipes): NP_001116380; 罗非鱼(Oreochromis niloticus): XP_005467279; 人(Homo sapiens):NP_001092092; 小鼠(Mus musculus): NP_918948;果蝇(Drosophila melanogaster): NP_476658; 爪蟾(Xenopus laevis): XP_018107247。

团头鲂nanos3 mRNA在不同发育时期和成体组织中的表达分析根据已获得的团头鲂nanos3基因序列, 设计半定量及定量引物(表1)。以β-actin作为内参, 采用半定量(定量)方法检测团头鲂nanos3基因mRNA在不同发育时期及成鱼不同组织中的表达情况。

pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR 质粒的构建、mRNA合成及显微注射实验以团头鲂卵巢cDNA为模板, 以XhoⅠ-mananos3UTR-S和XbaⅠ-mananos3UTR-A为引物(表1)进行PCR扩增。其产物经双酶切后插入到pCS2+的载体上得到pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR质粒。质粒pCS2-SP6∶EGFP-zfnanos3-3′UTR和pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR, 分别使用NotⅠ和XbaⅠ线性化后, 通过mMessage mMachine sp6 UltraKit(Thermo Fisher Scientific)体外转录试剂盒合成和纯化mRNA。合成的mRNA用超微量分光光度计测浓度和纯度, 用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。将合成的mRNA分别注射进入1细胞期团头鲂和斑马鱼的胚胎中, 在斑马鱼发育至1 dpf和团头鲂发育至2 dpf时, 于荧光显微镜下观察各自PGCs被标记效率并作统计。

mananos3-3′UTR 点突变质粒的构建及显微注射实验利用BioEdit7.0和Clustal W将团头鲂和斑马鱼的3′UTR进行序列比对, 比对后分别设计突变引物mananos-mut1-F/mananos-mut2-F与mananos-mut-R, 并利用反向PCR构建pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR_mut1和pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR_mut2突变质粒。质粒经XbaⅠ线性化后用mMessage mMachine sp6 UltraKit (Thermo Fisher Scientific)体外转录试剂盒合成然后纯化mRNA, 注射1细胞期的斑马鱼胚胎, 在斑马鱼发育至1 dpf时, 观察胚胎荧光情况并作统计。

2 结果

2.1 团头鲂nanos3基因全长cDNA的克隆及序列分析

本研究利用RT-PCR和RACE方法成功获得团头鲂的nanos3基因全长 cDNA序列(GenBank登录号MH215557), 其全长为1027 bp, 包括48 bp的 5′非编码区(5′UTR), 490 bp的3′非编码区(3′UTR)和489 bp的开放阅读框(ORF)。该基因编码162个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示, 团头鲂Nanos3蛋白同其他物种的Nanos3蛋白具有较高的相似性, 与鲤科鱼类中的金线鲃(S. grahami)、鲤(C. carpio)、银鲫(C. gibelio)和斑马鱼(D. rerio)相似性较高, 依次为77.2%、77.1%、75.9%和69.2%; 同鲑科鱼类[大西洋鲑鱼(S. salar)和虹鳟(O. mykiss)]和哺乳类[人类(H. sapiens)和小鼠(M. musculus)]的相似性较低, 在34%—48.1%(图1A)。但是, 它们均拥有1个保守的RNA结合功能域。在该功能域里面包含一个锌指基序“CCHC CCHC”。基于蛋白质序列, 利用MEGA5.1软件构建NJ系统发育树(图1B), 结果显示团头鲂的Nanos3蛋白同鲤鱼和斑马鱼的Nanos3聚为一支。这表明团头鲂的Nanos3与鲤鱼和斑马鱼的Nanos3最为相近。

2.2 团头鲂nanos3 mRNA在不同发育时期和成体组织中的表达分析

我们利用半定量和荧光定量PCR方法检测了团头鲂不同发育时期胚胎以及成鱼不同组织中nanos3 mRNA表达水平。我们发现团头鲂的nanos3具有母源表达, 在胚胎发育早期(shield时期以前)均具有较高的表达。在bud时期之后,nanos3 mRNA的表达量逐渐减少。从受精后3—15d, 在幼鱼中很难检测到nanos3的表达 (图2A)。nanos3在团头鲂胚胎发育各时期的表达特征同该基因在其他鱼类胚胎发育中的表达特征相似[17—19], 这暗示了nanos3在鱼类中可能具有相对保守的表达调控机制。在成鱼各组织中,nanos3 mRNA在卵巢中高表达, 在肝、肾、肌肉、心脏、腮、脑、肠、脾和精巢等组织中不表达(图2B)。以上结果表明, 团头鲂nanos3不仅是一个母源基因, 还是一个卵巢特异高量表达基因。

图1 团头鲂Nanos3氨基酸序列比对及系统进化分析Fig. 1 The Alignment of predicted amino acid sequence of Megalobrama amblycephala Nanos3 with its homologs in selected vertebrates(A) and Neighbor-Joining phylogenetic tree (NJ tree) of Nanos3 homologs of selected vertebrates (B)

2.3 团头鲂nanos3-3′UTR能够稳定EGFP在PGCs中的表达

接下来, 我们分别在团头鲂和模式动物斑马鱼中研究了mananos3-3′UTR介导绿色荧光蛋白(EGFP)特异性标记PGCs的功能。我们将EGFP-mananos3-3′UTR mRNA或者EGFP-zfnanos3-3′UTR mRNA分别注射进入斑马鱼和团头鲂1细胞期受精卵, 并统计了非PGCs组织具有较强荧光(High background)和较弱荧光(Low background)的胚胎数。我们发现所有注射有以上任意一种mRNA的胚胎均能够标记PGCs, 其区别主要在于背景荧光强度上, 即nanos3-3′UTR介导mRNA在非PGCs组织中的降解效率(图3C、3D)。在注射有EGFP-zfnanos3-3′UTR mRNA的斑马鱼胚胎中, 绝大多数胚胎(98%,n=100)具有较弱的荧光背景; 而同样的mRNA注射进入团头鲂胚胎中, 大多数胚胎(96.4%,n=83)的荧光背景较强(图3C、3E)。在注射有EGFP-mananos3-3′UTR mRNA的团头鲂胚胎中, 有86.7%的胚胎(n=60)具有较弱的荧光背景, 而同样的mRNA注射进入斑马鱼胚胎中, 83.3%的胚胎(n=90)却具有较强的荧光背景(图3D、3F)。这些数据表明, 物种本身的nanos3-3′UTR能够更加特异地标记自身的PGCs。总之,mananos3-3′UTR具有同其他硬骨鱼类nanos3-3′UTR相似的功能, 除可以有效标记团头鲂的PGCs外, 也可以标记斑马鱼的PGCs。

图2 团头鲂nanos3在胚胎发育不同时期和成体不同组织表达谱Fig. 2 The expression level of mananos3 during embryogenesis and among different adult tissues

2.4 团头鲂nanos3-3′UTR表达调控区域的鉴定

在斑马鱼中, miR430通过结合nanos3-3′UTR序列介导mRNA在体壁细胞中的降解[20,21]。经典的miR430识别位点为GCACUU[22]。通过比对团头鲂和斑马鱼nanos3-3′UTR序列, 我们发现在团头鲂nanos3-3′UTR的173—178 nt位置具有一个潜在的miR430识别位点GCACUA (WT, “_”标识出了与经典miR430识别位点不同的碱基)(图4A、4B)。我们通过设计引物(表1), 将mananos3-3′UTR的该位点分别突变为miR430经典的识别位点GCACUU(mut1)和不能识别的位点CUACUA (mut2, “_”指出了与经典miR430识别位点不同的碱基)(图4B), 并以斑马鱼为模式动物进一步探究该位点是否有利于EGFP在非PGCs细胞中有效降解从而使PGCs能够被EGFP更特异的标记。通过观察1dpf的胚胎,我们发现在注射有EGFP-mananos3-3′UTR WT的群体中, 具有高背景的胚胎占比73%(n=100); 在注射有EGFP-mananos3-3′UTR mut1 (突变位点理论上能够被miR430更好地识别)的群体中, 具有高背景的胚胎得到明显减少(40%,n=90); 而在注射有EGFP-mananos3-3′UTR mut2 (突变位点理论上不能被miR430识别)的群体中, 具有高背景的胚胎进一步增多(87%,n=120)(图4C)。该数据表明团头鲂nanos3-3′UTR中的序列“GCACUA”可能是miR430识别的位点。

图4 团头鲂nanos3-3′UTR miR430结合位点的鉴定Fig. 4 Identification of miR430 binding motif in mananos3-3′UTR

3 讨论

本研究首次克隆了团头鲂的nanos3 全长cDNA(mananos3, GenBank: MH215557)。序列分析发现预测的Mananos3氨基酸序列与鲤科鱼类相似性较高, 同鲑科鱼类、哺乳类、非脊椎动物和两栖类的相似性较低。在进化树上, 其与鲤和斑马鱼被聚到同一分支上。虽然nanos3在不同物种间的序列差异较大, 但是其RNA结合功能域的氨基酸序列高度保守。定量和半定量PCR结果显示,Mananos3具有母源表达, 并在胚胎发育早期高量表达, 而在PGCs特化完成后表达量逐渐减少。这种表达模式与斑马鱼[19]、家蚕(Bombyx mori)[17]、文昌鱼(Branchiostoma)[18]非常相似。综上,nanos3基因蛋白序列及其mRNA表达模式的保守性暗示nanos3在不同物种中可能具有相似的生物学功能。

早在2006年, Saito等[10]就使用斑马鱼nanos3基因的3′UTR序列插入到EGFP开放阅读框下游, 介导EGFP在青鳉(Oryzias latipes)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)、金鱼(Carassius auratus)等8种鱼类的PGCs中特异稳定的表达。在本研究中, 我们同样发现mananos3-3′UTR和zfnanos3-3′UTR均可以标记团头鲂和斑马鱼的PGCs。通过比较发现, 利用mananos3-3′UTR标记团头鲂本身的PGCs能使其他组织中的荧光(背景噪声信号)更弱。因此,mananos3-3′UTR比zfnanos3-3′UTR更加适合团头鲂PGCs的特异性标记, 这为将来开展基于团头鲂PGCs的遗传操作提供便利。

EGFP-nanos3-3′UTR之所以能够特异性标记PGCs, 主要是由于两个方面的分子机制共同作用。一方面, 在体细胞中, miR430能够识别并结合到nanos3-3′UTR上的特殊位点从而介导mRNA的降解[20]。另一方面, 在PGCs中, 生殖细胞特异的RNA结合蛋白Dnd1能够结合到nanos3-3′UTR上富含尿嘧啶区域从而保护mRNA免受miR430介导的RNA降解[21]。在本研究中, 我们在团头鲂nanos3-3′UTR中发现了一个非经典的nanos3 miR430结合位点GCACUA, 对其进行点突变后, 发现该序列的改变可以影响Mananos3-3′UTR对斑马鱼PGCs的标记效率。所以我们推测,mananos3同样存在通过miR430介导的mRNA降解及在生殖细胞中收到Dnd1蛋白保护的转录后调控机制, 并且mananos3-3′UTR与miR430结合位点可能包含GCACUA。