太原地区丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

王 琰 朱新宇 王 霞 王 东

HCV是黄病毒科肝炎病毒属RNA正链病毒，由于HCV基因组的变异性，存在不同基因型，我国几种主要的基因型 1a、1b、2a、2b、3a均有报道[1]。HCV 感染后临床表现程度轻重与所感染基因型有一定关系，1b型较非1b型肝功能损害明显，易导致严重的疾病。研究表明，基因1b型是对干扰素治疗无应答的独立性预测因子[2，3]。1a、2a、3 型对干扰素疗效较好，1b 型几乎没有疗效[4]。由于1b型患者对干扰素治疗的敏感性较低，导致1b型病毒在体内存在时间较长，因长期感染而导致肝硬化和肝癌[5]。本试验选择HCV保守的5’非编码区（5’UTR区）作为扩增片段，采用限制性片段长度多态性分析法（RFLP法）对本组患者进行HCV基因型的检测，了解本地区患者主要基因型，分析基因型与病情的关系。

材料与方法

一、研究对象 收集山西医科大学第一医院感染病科和我院2005年7月～2006年8月住院的丙型肝炎患者62例，男性34例，女性28例，平均年龄49.9±12.2岁。诊断符合2000年9月西安第10次全国传染病与寄生虫病和肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准。其中慢性肝炎轻度14例，中度39例，重度5例，肝硬化4例。病例纳入标准：血清抗-HCV阳性、HCV RNA＞80copies/ml，伴或不伴肝功能异常。

二、引物的合成和试剂来源 自Genebank中查找HCV 1a、1b、2b、3a型全序列，查找各型 5’UTR 区共同序列，并以此自行设计引物。外引物：S1（nt34～54）：5’-ATCACTCCCCTGTGAGGAAC-3’；S2（nt279～299）：5’-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3’。内引物：S3（nt39～59）：5’-TCCCCTGTGAGGAACTACTG-3’；S4 （nt274～294）：5’-TCAGGCAGTACCACAAGGCC-3’。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。主要试剂来源：Trizol购自北京博迈德科技发展有限公司；Taq DNA聚合酶及dNTP购自上海杰美基因医药科技有限公司；氯仿、异丙醇、乙醇购自北京北化精细化学品有限公司；AMV反转录酶购自Promega公司；HaeⅢ购自TBD生物工程有限责任公司；Bsh1236Ⅰ购自华美生物工程有限公司。

三、HCV RNA提取、AMV反转录 所有入选病例及对照清晨空腹肘静脉采血4ml，12000rpm离心10分钟，取上清，统一置于-70℃冰箱保存待检。采用Trizol法提取上述血清中病毒RNA：取血清30μl加入Trizol溶液、氯仿及异丙醇，经乙醇（预冷）振荡洗涤，提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。在 EP 管中依次加入模板 RNA、oligo（dT）16、dNTP mixture、RNase Inhibitor、AMV 及 DEPC 水，离心混匀，42℃保温1小时，95℃保温5分钟后冰上冷却，进行反转录。该反转录得到的cDNA用于PCR扩增。

四、巢式PCR扩增和酶切反应 在EP管中依次加入 cDNA 模板，Taq DNA 聚合酶，10×PCR buffer，上游引物（25mM），下游引物 1μl，dNTP，灭菌去离子水，置PTC-100型PCR扩增仪扩增，经95℃预变性4min，95℃变性 30sec，55℃退火 30sec，70℃延伸 30 sec，70℃延伸5min，进行35个循环后得到第一轮扩增产物。以第一轮反应产物为模板，相同条件下进行第二轮扩增。反应产物鉴定：取第二轮PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察结果。待在256bp左右出现明显的DNA条带，再进行下一步的酶切反应。取第二轮PCR产物，分别加入19.5μl HaeⅢ和Bsh 1236Ⅰ及buffer溶液，在37℃水浴中孵育2h后，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

五、统计学方法 计数资料采用x2检验，统计数据经SPSS11.5统计软件处理，P＜0.05有显著性差异。

结 果

一、HCV基因型分布 结果显示：第二轮扩增产物为 256bp条带；1a及 1b型由 HaeⅢ酶切得到243bp、18bp两条片断，1a型由Bsh 1236Ⅰ酶切得到231bp和25bp两条片断，1b型由1236Ⅰ酶切得到201bp、30bp和 25bp三条片断（图 1）；2a型由 HaeⅢ酶切得到 78bp、106bp、56bp和 18bp四条片断，无1236Ⅰ酶切位点（图2）；3a型由HaeⅢ酶切得到80bp、158bp和18bp三条片断，由1236Ⅰ酶切得到28bp、203bp和25bp三条片断（图 3）；1b/2a混合型如图4。分析结果表明62例丙型肝炎患者中，HCV基因型以1b型为主，占69.4%（43/62），2a型14.5%（9/62），1b/2a型 8.1%（5/62），1a型、3a型各 1例，分别占1.6%，未分型者3例，占4.8%，无2b型，未见有其他型分布。

图1 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

图2 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

图3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

图4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

二、基因型与患者病情关系 以1b型和其他型病例中不同病情病例所占比例为依据进行“x2检验”，探讨基因型与病情严重程度之间的关系。x2检验表明，1b型与其他型病情构成存在差别（x2=12.54，P＜0.005）。结合本资料分析表明：1b型感染所致疾病病情较其他型更为严重。

表1 不同基因型中患者病情的比较

讨 论

HCV基因组变异明显，平均每个位点核苷酸变异频率约10-3/年[1]，因此HCV存在不同基因型。自1989年Choo获得首株HCV的基因克隆，并完成了核酸序列测定以来，目前已有许多关于HCV全序列及部分序列的报道。目前，根据Simmonds分型系统全世界范围内已克隆到的分离株可分为6个基因型，68个亚型[6]。本实验采用了对较为保守的5’UTR区进行RFLP法分型，该区对1a～6a不同基因型的cDNA均能获得良好的扩增效果[7]。不同地区HCV基因分布有所差异，欧美国家以1a为主，亚洲包括我国以1b型为主，我国几种主要的基因型 1a、1b、2a、2b、3a均有报道[1]。本试验所得结果与国内报道相近[8]。本次试验检测HCV基因型结果显示1b型占优势，2a型次之，其次是1b/2a混合型，并检出1a和3a型各一例。该结果与吴立平[9]等人的研究结果相似。另有3例未检出者，可能是本实验未涉及到的其它基因型，也可能是由于RNA污染或其他技术上的问题，有待进一步完善。

1b型有较高的复制能力和血清反应性，较强的肝细胞损害作用及较低的IFN治疗反应性等[1]。本实验中，1b型患者中度及重度和肝硬化中比例较高，分别占到84.6%和55.6%，而9例2a型患者轻度7例，中度1例，重度1例，主要为轻中度患者，5例1b/2a混合型患者2例为中度，3例为重度及肝硬化，另有1a型1例为轻度，3a型1例为轻度。中重度患者多为1b型，该型患者病情较重，且较易发展为肝硬化。该结果与Delice D等研究结果相同，HCV基因型与特定的组织病理学程度、肝脏炎症程度相关[10]。

我们的研究结果与其他地区的检测结果相似，这对当地丙型肝炎患者的治疗和预后判断有一定的指导意义。本研究的不足之处在于：样本例数较小，研究对象以慢性肝病为主，缺乏无症状患者及重型肝病患者，有必要扩大样本量，选择人群资料进一步研究。HCV基因型可以预测IFN对HCV的抗病毒治疗效果[11～12]。HCV基因型也可指导患者干扰素治疗所需的疗程[13～14]。因此，治疗前检测HCV基因型有重要的临床意义。

[1]中华医学会传染病与寄生虫病学会肝病学会.病毒性肝炎防治方案 [J].中华肝脏病杂志，2000，8（6）：324-329.

[2]NONEZ M.Brief report role lf hepatitis C virus genotype in the development of severe transaminase elevation after the introduction of antiretroviral therapy[J].J Acquir Immune Defic Syndr，2002，30：65-68.

[3]赵桂珍，安萍，黄芬.丙型肝炎病毒基因型及其病毒RNA定量与干扰素疗效的关系[J].中国医科大学学报，2000，12：445-446.

[4]DAVIS GL，LAU JY，URDEA MS，et al.Quantitative defection of hepatitis C virus RNA wish a solid phase signal amplification method：definition of optimal conditions for specimen collection and clinincal application in interferon-treated patients[J].Hepatology，1994，19：1337-1341.

[5]CLUCK T.Parameters predicting response to alpha-interferon treatment in chronic hepatitis C[J].Hepatogastroenterology，1997，44：484-491.

[6]SIMMONDS P，BUKH I，COMBET C，et al.Consensus proposals for a system of nomenclature of nomenclature of hepatitis C virus genotypes[J].Hepatology，2005，42：962-973.