千里光总黄酮体外抗肿瘤和抗病毒活性研究

何忠梅， 白 冰， 王 慧， 孙佳明， 宗 颖

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春130116;2.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林 长春130012;3.长春中医药大学，吉林长春130117)

千里光又名千里及、九里明等，系菊科多年生植物千里光Senecio scandens Buch-Ham.的全草，全国大部分地区均有分布，是我国应用历史悠久的常用中药。该药性寒味苦辛，具有清热解毒、明目退翳、杀虫止痒的功效。主治流感、上呼吸道感染、肺炎、急性扁桃腺炎、腮腺炎、急性肠炎、菌痢、黄疸型肝炎、胆囊炎、急性尿路感染、滴虫性阴道炎、烧烫伤［1］。HPLC指纹图谱及ESI-MS分析表明黄酮是千里光的主要成分［2］，而黄酮类化合物一般具有抗炎、抗微生物、抗肿瘤等药理作用［3］，已有文献报道千里光总黄酮具有抗炎作用［4］和抗大肠杆菌作用［5］，而千里光总黄酮是否具有抗肿瘤和抗病毒作用尚未见报道，本研究采用MTT法检测千里光总黄酮对人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901和人乳腺癌细胞株MCF-7的生长抑制情况，采用细胞体外病变效应(CPE)法检测千里光总黄酮对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用，为阐明千里光药材活性物质基础提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 千里光总黄酮 由本实验室采用甲醇提取千里光药材，石油醚除杂质，乙酸乙酯萃取和聚酰胺层析分离提取，冷冻干燥得深黄色粉末，0.1%乙醇溶解，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存备用。

1.2 细胞株与病毒株 人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901和人乳腺癌细胞株MCF-7均购于吉林省肿瘤医院。人宫颈癌传代细胞HeLa和人呼吸道合胞病毒(RSV)株均为预防医学科学院病毒研究所提供。

1.3 阳性对照药物 抗肿瘤阳性对照药物:5-氟尿嘧啶(5-FU，上海锐聪科技发展有限公司，批号20090612);抗病毒阳性对照药物:病毒唑注射液(安徽联谊制药厂，批号20090401)。

1.4 试剂 RPMI-1640培养基，MTT(四甲基噻唑蓝)，二甲基亚砜均为Sigma产品。胎牛血清为长春生物制品研究所产品。胰蛋白酶为日本生产上海化学试剂厂分装。PBS，北京鼑国生物技术公司。

1.5 仪器 MCO-1750型CO2培养箱，日本产;Model 680型酶标仪，美国产;BX50倒置显微镜，日本产;DFL-560型超净工作台，荷兰产;AG135型电子天平，瑞士产;自动高压灭菌器，日本产;培养瓶和96孔培养板均为丹麦产。

2 方法

2.1 细胞培养 将肿瘤细胞接种于含10%牛血清、100 U/mL青、链霉素的RPMI-1640培养液中，放入37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

2.2 MTT法 将细胞以1×105个/mL浓度接种于96孔培养板(100 μL/孔)中，待细胞贴壁后，实验组分别加入100 μL的各浓度的千里光总黄酮培养液，使最终浓度分别为 10、20、50、100 μg/mL，阳性对照组加入5-氟尿嘧啶，终浓度为4 μg/mL，阴性对照组加入含0.5%DMSO的培养液100 μL/孔，空白对照组加入等体积的培养液，每组各设4个平行孔。37℃，培养 68 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入 DMSO150 μL，混匀，酶标仪(λ=570 nm)测定吸光度(A570)，按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率［6］:肿瘤细胞生长抑制率(%)=［1-A570(实验组)/A570(对照组)］×100%。

2.3 药物对肿瘤细胞生长半数抑制浓度IC50的计算与统计学处理 直线回归法［7］:当细胞生长抑制率与药物浓度有对数关系时，以药物的对数浓度为横坐标，相应的细胞生长抑制率为纵坐标，求出直线回归方程，根据该方程计算出IC50。计量资料以±s表示，多组均数间比较用F检验，两组间均数差异以SPSS统计软件进行t检验［6］。

2.4 病毒滴度测定［8］将对数生长期的HeLa细胞接种于96孔培养板，37℃，5%CO2培养24 h，将RSV病毒株作10倍系列稀释为10-1、10-2、10-3……10-6，常规方法感染单层HeLa细胞，每个稀释度设4个复孔，同时设阴性对照，37℃，5%CO2培养，观察并记录每孔细胞病变情况，用karber法计算病毒滴度TCID50。

2.5 药物细胞毒性实验 用细胞维持液将千里光总黄酮和阳性对照药病毒唑作2倍系列稀释，分别加入HeLa单层细胞上，每个剂量设4个平行孔，每孔0.2 mL，37℃，5%CO2培养箱培养3 d，每天镜下观察细胞病变程度(CPE)，采用 Reed-Muench［9］法计算半数毒性浓度(TC50)。

2.6 药物对病毒致细胞病变作用的影响［10］在HeLa细胞上加入100TCID50的病毒液，37℃吸附1 h后洗去病毒液，更换不同浓度的千里光总黄酮维持液和病毒唑溶液，同时设病毒对照和细胞对照，置37℃，5%CO2培养箱内培养，每天在倒置显微镜下观察细胞病变，每3天更换1次药液，连续7 d，记录各孔CPE，计算千里光总黄酮半数有效浓度(EC50)和治疗指数TI(TI=TC50/EC50)。

3 结果

3.1 千里光总黄酮的体外抗肿瘤作用 千里光总黄酮对人肝癌细胞株 SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901和人乳腺癌细胞株MCF-7都有明显的抑制作用，并且抑制率与总黄酮浓度呈正相关。千里光总黄酮对以上3种瘤株的生长抑制率与药物浓度成对数关系，故采用直线回归法计算IC50，IC50分别为 48.73、61.32、31.26 μg/mL。结果见表 1。

3.2 病毒滴度 RSV病毒的TCID50即接种滴度为10-4的病毒0.1 mL/孔，可使50%细胞发生明显病变，实验用病毒浓度为100TCID50。

3.3 药物毒性 根据实验数据，采用Reed-Muench法计算，千里光总黄酮TC50=0.29 mg/mL，病毒唑TC50=1.20 mg/mL。

3.4 千里光总黄酮对RSV病毒增殖的抑制作用Kruskal-Wallis［11］检验法比较千里光总黄酮各剂量组与病毒对照组细胞病变程度。结果见表2，千里光总黄酮的160.0、80.0、40.0 μg/mL剂量组和病毒唑的60.0、30.0、15.0、7.5 μg/mL 剂量组均具有明显的抑制RSV增殖的作用。采用Reed-Muench法计算千里光总黄酮的EC50为38.3 μg/mL，千里光总黄酮的治疗指数(TI)为7.6;病毒唑的EC50为5.70 μg/mL，病毒唑的 TI为 210.5。

表1 千里光总黄酮对3种肿瘤细胞株的生长抑制作用(±s，n=4)Table 1 The inhibition of total flavonoids from Senecio scandens on growth of three kinds of tumor cells(±s，n=4)

表1 千里光总黄酮对3种肿瘤细胞株的生长抑制作用(±s，n=4)Table 1 The inhibition of total flavonoids from Senecio scandens on growth of three kinds of tumor cells(±s，n=4)

注:与阴性对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.01

组别 浓度SMMC7721平均A570(抑制率/%)SGC7901平均A570(抑制率/%)MCF-7平均A570(抑制率/%)阴性对照组00.763±0.018 0.818±0.013 0.926±0.012阳性对照组 4 μg/mL 0.412±0.008**(46.00%) 0.514±0.010**(37.16%) 0.594±0.010**(35.85%)10 μg/mL 0.598±0.010**(21.66%) 0.674±0.008**(17.68%) 0.632±0.008**(31.77%)千里光 20 μg/mL 0.495±0.007**(35.16%) 0.572±0.009**(30.19%) 0.516±0.012**(44.24%)总黄酮 50 μg/mL 0.369±0.006***(51.56%) 0.462±0.010**(43.63%) 0.364±0.008***(60.64%)100 μg/mL 0.229±0.007***(69.98%) 0.257±0.006***(68.61%) 0.160±0.007***(82.73%)

表2 千里光总黄酮和病毒唑对RSV的抑制作用Table 2 The inhibition of total flavonoids from Senecio scandens and ribavirin on growth of RSV

4 讨论

本实验采用MTT法，选用人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901和人乳腺癌细胞株MCF-7三种瘤株，对千里光总黄酮进行了体外抗肿瘤的实验研究。结果证实，千里光总黄酮有明显的体外抑瘤作用，对SMMC-7721、SGC-7901和MCF-7三种瘤株生长的半数抑制浓度(IC50)分别为48.73、61.32、31.26 μg/mL，表现出很强的体外抗肿瘤活性。

在进行体外抗肿瘤实验的同时，本实验还采用细胞体外病变效应(CPE)法检测了千里光总黄酮在人宫颈癌HeLa细胞中对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用。结果表明，千里光总黄酮半数中毒浓度(TC50)为0.29 mg/mL，抑制RSV的半数有效浓度(EC50)为 38.3 μg/mL，治疗指数(TI)为 7.6，表现出很强的体外抗病毒活性。

本实验初步确定千里光总黄酮为千里光体外抗肿瘤和抗病毒的活性部位，为揭示千里光抗肿瘤和抗病毒作用及其物质基础提供了实验数据，下一步应进行千里光总黄酮其它的体外和体内实验来进一步考查它的抗肿瘤和抗病毒活性。

［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科技出版社，1999:1390.

［2］张朝凤，陈录新，张 勉，等.千里光药材的HPLC指纹图谱及ESI-MS分析［J］.中国中药杂志，2008，33(18):2093-2096.

［3］唐 栩，许东晖，梅雪婷，等.26种黄酮类天然活性成分的药理研究进展［J］.中药材，2003，26(1):46-49.

［4］张文平，陈惠群，张文书，等.千里光总黄酮的抗炎作用研究［J］.时珍国医国药，2008，19(3):605-607.

［5］张文平，刘波兰，李小花，等.血清药理学方法研究千里光抗大肠埃希菌的作用机制［J］.中药药理与临床，2009，25(3):47-49.

［6］梁 洁，甄汉深，王新盛，等.美味猕猴桃根中三萜类化合物的体外抗肿瘤实验研究［J］.中药材，2009，32(6):959-962.

［7］王天山，陆跃鸣，马国祥，等.鼓槌石斛中化学成分对K562肿瘤细胞株生长抑制作用体外实验［J］.天然产物研究与开发，1997，9(2):1-3.

［8］朱艳梅，王一飞，张美英，等.蜈蚣藻多糖的提取分离及抗病毒活性的研究［J］.中药材，2006，29(3):256-259.

［9］黄祯祥，洪 涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术［M］.北京:科学出版社，1990:130-141.

［10］王秀琴，李洪源，刘鑫妍，等.甘草抗病毒有效部位(GD4)体外抑制呼吸道合胞病毒作用的研究［J］.中药材，2006，29(7):692-694.

［11］孙振球.医学统计学［M］.北京:人民卫生出版社，2002:477.