25种中草药体外抑制鼻咽癌细胞增殖活性研究

吴 霞， 李药兰*， 张冬梅， 叶文才

(1.暨南大学中药及天然药物研究所，广东广州510632;2.暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省重点实验室，广东广州510632)

鼻咽癌是我国南方地区高发的恶性肿瘤，在广东、广西、湖南等地的发病率尤其高［1］。据世界卫生组织统计，中国广东省是鼻咽癌的高发地区，因此，鼻咽癌素有“广东癌”之称。目前鼻咽癌的治疗以放疗和化疗为主，临床上常用的化疗药如环磷酰胺、氟尿嘧啶及顺铂等对鼻咽癌有一定疗效，但毒副作用大，还存在远期效果不明显和耐药性等问题［2-3］。因此，开发新型的治疗鼻咽癌药物是很有必要的。广东位于我国南方，温暖潮湿的气候使广东的药用植物资源丰富，民间多年来都有采用草药及其复方治疗鼻咽部疾病的习惯。广州市奇星药业有限公司生产的中成药鼻咽清毒颗粒，具有清热解毒，化痰散结的功效，临床上用于治疗热毒蕴结的鼻咽肿痛，以及鼻咽部慢性炎症、鼻咽癌放射治疗后分泌物增多等症。有研究指出，鼻咽清毒颗粒在临床上可用于鼻咽癌的辅助治疗［4］，民间也有将该中成药用于治疗鼻咽癌。本研究拟从用于鼻咽癌辅助治疗的中成药鼻咽清毒颗粒和广东民间用于治疗鼻咽部疾病的中药中选择25种中药，对它们进行抗鼻咽癌活性筛选，为寻找具有进一步研究价值的抗鼻咽癌中药打下科学基础。

1 材料与方法

1.1 细胞 鼻咽癌细胞CNE，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。实验前复苏培养，用含10%新生牛血清(杭州四季青公司)和1%双抗(白云山制药股份有限公司)的RPMI 1640培养液(GIBCO，美国)培养，置于37℃、5%CO2培养箱内。取对数生长期、生长良好的细胞用于试验。

1.2 实验用中药 实验用25种中药(见表1)购自广州通济堂药店，由广东省药材公司高级工程师麦镇球先生鉴定。25种中药干燥、粉碎后备用。

1.3 中药提取物的制备

醇提物的制备:在10 g粉碎的中药中加入100 mL 95%乙醇，40°C下超声提取1 h，滤出提取液，重复3次，合并3次提取液，减压浓缩、干燥得乙醇提取物。

水提物的制备:在10 g粉碎的中药中加入100 mL水，加热回流1 h，滤出提取液，重复3次，合并3次提取液，减压浓缩、干燥得各中药水提物。

挥发油的制备:提取部分挥发油含量较高的中药的挥发油。在100 g粉碎的中药中加入500 mL水，用挥发油提取器提取5 h，用石油醚萃取挥发油，萃取液中加入无水硫酸钠干燥，过滤，挥去石油醚，得挥发油。

将以上3种中药提取物各称取2 mg，用DMSO溶解，配制成40 mg/mL的溶液，再分别用培养液稀释成100 μg/mL的溶液备用。各中药及其提取物和提取率见表1。

1.4 中药提取物抗鼻咽癌细胞活性测定

1.4.1 中药提取物抗鼻咽癌细胞活性筛选［5］将MTT溶于磷酸缓冲液(PBS)，配成浓度为5 mg/mL的MTT溶液。将1×104浓度的细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后吸去培养液，加入100 μg/mL的药物，空白对照组加入等量的培养液，每种药物重复4孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入30 μL MTT，37℃继续培养4 h后，吸去多余的MTT和培养液，加入DMSO(100 μL/孔)溶解。经振荡器振荡后，酶标仪上实验波长570 nm，参比波长630 nm，测定各孔吸光度OD值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率IR(%)=(1-试验组OD值/空白对照组OD值)×100%。

表1 供试中药及其提取物和提取率

1.4.2 活性提取物对鼻咽癌细胞半数抑制浓度(IC50)的测定［6］肿瘤细胞悬液(1×104细胞/mL)接种于平底的96孔板中，37℃条件下、5%CO2培养箱中培养过夜使细胞贴壁。然后孔中的培养液替换成含有不同浓度检测样品的生长培养基，每个浓度重复4孔，空白对照组加入等量的培养液，阳性对照药为顺铂。继续培养48 h后，各孔加入30 μL MTT，4 h培养之后小心地吸出上清液，加入100 μL DMSO，振荡器振荡后，在波长570 nm/630 nm下测OD值，计算样品对细胞增殖的抑制率，以半数抑制浓度IC50(50%inhibitory concentration)表示。

2 结果与讨论

2.1 各中药的水提物、醇提物和部分挥发油对CNE细胞的体外增殖抑制结果 见图1、2和3(各中药与表1编号对应)。

图1 各药材水提物对CNE细胞增殖抑制率/%

从图1可知，在浓度为100 μg/mL时，所有水提物对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用均不高，其中辛夷水提物(6号样品)、鸭脚木水提物(22号样品)和六棱菊水提物(24号样品)在浓度为100 μg/mL时，对CNE的增殖抑制率分别为24.40%、24.43%和26.48%。

图2 各中药醇提物对CNE细胞增殖抑制率/%

由图2可知，重楼(10号样品)和地胆草(16号样品)的醇提物对CNE细胞有很好的体外增殖抑制活性，在浓度为100 μg/mL时，两者对CNE的增殖抑制率分别为83.10%和66.50%，另外，卤地菊(15号样品)和两面针(18号样品)的醇提物对CNE细胞的增殖抑制率分别为29.02%和28.88%。

图3 部分中药挥发油对CNE细胞增殖抑制率/%

由图3可见，在浓度为100 μg/mL时，所有挥发油对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用均没有超过40%，但鸭脚木(22号样品)和香薷(25号样品)的挥发油对CNE细胞有一定的增殖抑制活性，两者在浓度为100 μg/mL时对CNE细胞的增殖抑制率分别为28.02%和30.21%。

2.2 重楼和地胆草醇提物对CNE细胞半数抑制浓度(IC50)的测定结果 如表2所示。

表2 重楼和地胆草醇提物对CNE细胞半数抑制浓度(IC50)

进一步的测试结果表明，重楼和地胆草的醇取物对CNE细胞的 IC50分别为(31.73±0.032)μg/mL和(50.71±0.063)μg/mL(表2)。

重楼是中成药鼻咽清毒颗粒的组成之一，曾有研究表明，重楼的水提物和醇提物及其中的皂苷对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制作用［7-9］。我们的研究结果表明，重楼的醇提物对鼻咽癌细胞有很强的增殖抑制活性。地胆草在华南地区的资源丰富、民间应用广泛，有文献记载，地胆草在民间有用于治疗鼻咽癌［10］。本研究的结果一方面为这些中药的民间应用提供了部分的科学依据，另一方面，这两个中药在治疗鼻咽癌的临床和民间应用，增强了我们进一步研究它们的抗鼻咽癌活性的信心。目前，对重楼和地胆草的抗鼻咽癌有效成分和作用机制的研究工作正在进行中。

另外，根据本实验的筛选结果，卤地菊和两面针醇提物及鸭脚木和香薷的挥发油对CNE细胞有一定的体外抑制活性，也有进一步研究的价值。

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