芙蓉凝胶质量标准研究

曾祖平， 刘 钊， 张 虎， 何 薇， 王 宏， 王永红

(首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所，北京100010)

芙蓉膏为北京中医医院皮外科常用的传统软膏剂，由黄连、黄芩、大黄等药味组成，具有清热解毒，活血消肿的功效，主治丹毒、蜂窝组织炎、疖、痈初起等［1］。原制剂为药材粉碎后直接加入凡士林基质中，药材有效成分利用度低，软膏油腻，易污染衣物。为提高其临床疗效，便于使用，我们将芙蓉膏改进为凝胶剂，对其工艺进行了研究［2］。本实验建立了芙蓉凝胶的质量标准。

1 材料和仪器

芙蓉凝胶(自制);芙蓉凝胶药材饮片(北京杏林药业有限责任公司);盐酸小檗碱对照品(批号110713-200208，含量测定用)、黄芩苷对照品(批号110715-200514，含量测定用)、盐酸巴马汀对照品(批号:110732-200907，按盐酸巴马汀为86.1% 计，供含量测定用)、大黄素(批号756-9707)、大黄素甲醚(批号758-9301)、大黄酸(批号0757-200206)、大黄酚(批号 796-9303)、芦荟大黄素(批号 795-9301)、熊果酸(批号 110742-200516)、汉黄芩素(1514-200202)、掌叶大黄对照药材、黄连对照药材、关黄柏对照药材、黄芩对照药材均购自中国药品生物制品检定所;水为重蒸水;甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，硅藻土为化学纯，其余试剂为分析纯;滤膜(孔径0.45 μm ，德国 MEMBRANA 公司)。

1100系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司，包括二元泵、自动进样器、多波长检测器)，AJ150L电子精密天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，SK7210HP型KUDOS超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)，SNB-2型数字旋转黏度计(上海地学仪器研究所)，JC402PH/Mv智能式数字显示酸度计(北京创业仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 性状 本品为棕黄色稠厚液体。

2.2 鉴别

2.2.1 泽兰的薄层色谱鉴别［3］157取本品5 g，加硅藻土5 g分散，晾干，加入乙醚30 mL，超声10 min，滤过;滤渣备用;滤液挥去溶剂，残渣用甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。按处方配比称取除泽兰以外的其它药材，按芙蓉凝胶制备方法制备凝胶，并按供试品溶液的制备方法制备泽兰阴性对照液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照《中国药典》2005年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一含0.3%羧甲基纤维素钠的硅胶G板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同紫红色斑点;365 nm下显相同橙黄色荧光斑点，阴性对照无干扰，见图1。

图1 泽兰的薄层色谱图Fig.1 TLC of Herba Lycopi

2.2.2 大黄的薄层色谱鉴别［3］17供试品溶液制备同2.2.1项;同2.2.1项中方法制备大黄阴性对照液。另取掌叶大黄对照药材粉末0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，滤过，取滤液5 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，再加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚和大黄素对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液;再吸取上述对照品溶液各1 mL，混匀，作为对照品溶液。照《中国药典》2005年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL、对照药材和对照品溶液各5 μL，分别点于同一含0.3%羧甲基纤维素钠的硅胶H板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同5个橙黄色荧光斑点;置氨蒸气熏后，斑点变为红色，阴性对照无干扰，见图2。

图2 大黄的薄层色谱图Fig.2 TLC of Radix et Rhizoma Rhei

2.2.3 黄连、关黄柏的薄层色谱鉴别［4］2.2.1项中乙醚提取后的滤渣挥尽溶剂，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)50 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。按处方配比称取除黄连、关黄柏药材以外的其它药材，按芙蓉凝胶制备方法制备凝胶，并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。另取黄连对照药材、关黄柏对照药材各0.1 g，分别加甲醇10 mL，超声处理20 min，滤过，作为对照药材溶液。再取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品，分别加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取上述两种对照品溶液等比例混合，作为混合对照品溶液。照《中国药典》2005年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL、对照药材溶液、对照品溶液和混合对照品溶液各1μL，分别点于同一含0.3%羧甲基纤维素钠的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3 ∶3.5 ∶1 ∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，加入展开箱一侧槽中，另侧槽加入与展开剂等体积的浓氨试液共同预平衡20 min，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同黄色荧光斑点，阴性对照无干扰，见图3。

图3 黄连、关黄柏的薄层色谱图Fig.3 TLC of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri Amurensis

2.2.4 黄芩的薄层色谱鉴别 供试品溶液制备同2.2.1项。同2.2.1项中方法制备黄芩阴性对照液。另取黄芩对照药材0.1 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)4 mL，浸泡 1 h，超声处理 30 min，滤过，蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。照《中国药典》2005年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，再取汉黄芩素对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL、对照药材和对照品溶液各2 μL，分别点于同一含0.3%羧甲基纤维素钠的硅胶G板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，有相同的暗绿色斑点，阴性对照无干扰，见图4。

图4 黄芩的薄层色谱图Fig.4 TLC of Radix Scutellariae

2.3 检查

2.3.1 pH值 取本品1 g，称定，加蒸馏水10 mL使溶解，照《中国药典》2005年版一部附录ⅦG pH值测定法试验，pH值为5.50～6.50。

2.3.2 黏度 照《中国药典》2005年版二部附录ⅥG黏度测定法中第二法测定，动力黏度为8 500～12 500 mPa·s。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm);流动相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾-三乙胺(25∶75∶0.2);流速:1.0 mL/min;检测波长:276 nm(黄芩苷)，265 nm(盐酸巴马汀、盐酸小檗碱);柱温:室温;理论板数按黄芩苷峰计算不低于2 500，按盐酸巴马汀计算不低于4 000，按盐酸小檗碱计算不低于3 000。

2.4.2 对照品溶液的制备及线性关系 精密称取已干燥(60℃减压干燥4 h)的黄芩苷对照品0.012 6 g，用甲醇定容于10 mL量瓶中，制成浓度为1.26 mg/mL的黄芩苷对照品贮备液;分别精密称取已干燥(100℃干燥5 h)的盐酸巴马汀对照品0.010 0 g、盐酸小檗碱对照品0.013 0 g，用甲醇分别定容于25 mL量瓶中，分别制成浓度为0.344 4 mg/mL的盐酸巴马汀对照品贮备液和0.52 mg/mL的盐酸小檗碱对照品贮备液。精密吸取上述黄芩苷对照品贮备液2 mL、盐酸巴马汀对照品贮备液3 mL和盐酸小檗碱对照品贮备液5 mL于同一10 mL量瓶中，制成黄芩苷(0.252 mg/mL)、盐酸巴马汀(0.103 3 mg/mL)和盐酸小檗碱(0.26 mg/mL)混合对照品溶液。分别进样 0.2、0.5、1、2、4 μL，按上述色谱条件测定，记录黄芩苷(276 nm)和盐酸巴马汀、盐酸小檗碱(265 nm)峰面积，分别以黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积积分值(Y)为纵坐标，以进样质量为横坐标(X)，进行线性回归，回归方程分别为黄芩苷:Y=3 562.3X+10.646(r=0.999 7)，盐酸巴马汀:Y=4 114.3X+52.091(r=0.999 6)，盐酸小檗碱:Y=4 607.6X-76.822(r=0.999 8)，表明黄芩苷在0.050 4～1.008 μg范围、盐酸巴马汀在0.020 7～0.413 3 μg范围、盐酸小檗碱在0.052～1.04 μg范围内呈良好的线性关系。色谱图见图5。

图5 黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱标准品HPLC图谱Fig.5 HPLC of berberine hydrochloride，palmatin hydrochloride and baicalin

2.4.3供试品溶液制备 取芙蓉凝胶约2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密称取等量硅藻土于同一锥形瓶中，将二者混合分散均匀;取混合物约0.4 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入流动相10 mL，称定重量，超声处理40 min，取出，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 稳定性试验:取凝胶的同一供试品溶液，每隔1 h左右进样测定1次，连续测定6个小时，结果黄芩苷RSD=1.09%，盐酸巴马汀RSD=1.35%，盐酸小檗碱RSD=1.40%，表明6 h内黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱基本稳定。

2.4.4.2 精密度试验:同一供试品溶液，连续进样5次，记录黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的峰面积，计算黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积RSD分别为0.53%、0.42%和0.44%(n=5)，表明仪器精密度符合要求。

2.4.4.3 专属性试验:按处方比例分别制备不含黄连、黄柏的凝胶和不含黄芩的凝胶，照2.4.3项方法制备黄连、黄柏和黄芩的阴性对照溶液，测定，结果显示在与黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱保留时间相应的位置上未见相关吸收峰，说明本品中其他成分对黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的测定无干扰。色谱图见图6，7。

图6 黄芩阴性HPLC图谱Fig.6 HPLC of blank of Radix Scutellariae

图7 黄连、关黄柏阴性HPLC图谱Fig.7 HPLC of blanks of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri Amurensis

2.4.4.4 重复性试验:取同一批芙蓉凝胶，共6份，按2.4.3项方法制备供试品溶液，按2.4.1项色谱条件进行测定。结果芙蓉凝胶中黄芩苷含量RSD=1.14%(n=6)，盐酸巴马汀含量RSD=1.37%(n=6)，盐酸小檗碱含量 RSD=1.57%(n=6)，表明方法重复性良好。色谱图见图8。

图8 芙蓉凝胶样品HPLC图谱Fig.8 HPLC of sample of Furong Gel

2.4.4.5 回收率试验:精密吸取黄芩苷对照品贮备液4 mL、盐酸巴马汀对照品贮备液4 mL和盐酸小檗碱对照品贮备液6 mL于同一25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得黄芩苷(0.201 6 mg/mL)、盐酸巴马汀(0.055 1 mg/mL)和盐酸小檗碱(0.124 8 mg/mL)混合对照品溶液。取芙蓉凝胶约2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密称取等量硅藻土于同一锥形瓶中，将二者混合分散均匀;取混合物约0.2 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入流动相9.5 mL、混合对照品溶液0.5 mL，其余操作同2.4.3项供试品溶液的制备，按2.4.1项色谱条件进行测定。分别计算回收率，结果平均回收率黄芩苷为101.49%，RSD为1.18%(n=6)，盐酸巴马汀为100.49%，RSD为0.87%(n=6)，盐酸小檗碱为101.23%，RSD为1.42%(n=6)。结果见表1。

表1 回收率试验结果Tab.1 Results of recovery test

2.4.5 样品测定 取3批样品，按供试品溶液制备方法制成供试液，精密吸取对照品溶液0.5 μL，供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量。结果见表2。

表2 芙蓉凝胶中黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量测定结果Tab.2 Contents of berberine hydrochloride，palmatin hydrochloride and baicalin in Furong Gel

3 讨论

3.1 曾经针对芙蓉叶中的芦丁等黄酮类成分进行了薄层层析鉴别，但阴性对照有干扰，高效液相色谱也显示阴性对照液中含有芦丁，与泽兰中含有芦丁成分的文献记载相符，故放弃。研究泽兰薄层层析时以熊果酸和齐墩果酸作为阳性对照，尝试了多种供试液制备方法和展开剂种类，目前的条件干扰小、斑点清晰，但仍不能分离熊果酸和齐墩果酸，原因是二者为同分异构体，化学性质极其相近。鉴别黄芩时，尝试了多种吸附剂和展开剂，制剂中的基质和其它成分总有干扰;现针对黄酮苷元成分进行鉴别，采用现行展开剂，可鉴别多种成分，斑点较为清晰。

3.2 含量测定时，分别对提取溶剂种类及用量、提取方法及时间进行了单因素考察，优选出的条件对芙蓉凝胶中黄芩苷和盐酸小檗碱的提取率高;HPLC分析时尝试过多种流动相，目前采用的流动相分离度、对称性等符合要求，可同时测定芙蓉凝胶中黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量。

［1］张志礼.中西医结合皮肤性病学［M］.北京:人民卫生出版社，2000:526.

［2］曾祖平，乔文越，刘 然，等.芙蓉凝胶的研制［J］.中国医院药学杂志，2009，29(19):15-18.

［3］中国药典［S］.一部.2005.

［4］药典委员会.中华人民共和国药典中药薄层色谱彩色图集［M］.广州:广东科技出版社，1993:70-71.