野生黄花苜蓿胚性愈伤诱导研究

摘要：为优化黄花苜蓿胚性愈伤培养条件，本研究以黄花苜蓿（Medicago falcata L.）为试验材料，探讨培养基、外植体、激素浓度以及凝固剂对黄花苜蓿胚性愈伤形成的影响。结果表明，以成熟胚为外植体接种至MS培养基的愈伤块呈淡黄色，质地为粘性且体积较大，该处理下添加1 mg·L-12，4-D和0.05 mg·L-1KT愈伤诱导率可达95.24%。利用该培养条件进一步探究了凝固剂对愈伤组织诱导的影响，发现培养基中添加6 g·L-1琼脂和7 g·L-1植物凝胶可以有效降低愈伤组织褐化率。因此，诱导黄花苜蓿最适培养基为：以成熟胚为外植体，其成分包括MS培养基，添加1 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-1KT+6 g·L-1琼脂/7 g·L-1植物凝胶。

关键词：黄花苜蓿；愈伤组织；成熟胚；凝固剂

中图分类号：S541.9""" 文献标识码：A" """"文章编号：1007-0435（2024）07-2143-08

Study on Embryogenic Callus Induction of Wild Medicago falcata L.

WANG Shu-shuan1， ZHANG Yu-tong1， SHI Ru-ru1， GAO Cui-ping1， GAO Xia1，

NIE Yu-dong2， SHI Feng-ling1*

（1.Key Laboratory of Grassland Resources Education， College of Grassland and Resources and Environment， Inner Mongolia

Agricultural University， Hohhot Inner Mongolia 010019， China; 2.Inner Mongolia Autonomous Region Forestry and

Grassland Seedling Station， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China）

Abstract：In order to optimize the induction of embryonic callus in alfalfa （Medicago falcata L.） from Xinjiang，the effects of culture medium，explants，hormone concentration and gelling agents on the formation of alfalfa callus tissue were investigated. The results showed that the callus inoculated into MS medium with mature embryo as explants were light yellow，viscous in texture and large in volume，the callus induction rate reached 95.24 % when 1 mg·L-12，4-D and 0.05 mg·L-1KT were added. The effect of coagulant on callus induction was further explored by using this culture condition，it found that the addition of 6 g·L-1 agar and 7 g·L-1 phytagel to the medium effectively reduced the browning rate of callus. Therefore，the optimal medium for inducing alfalfa was mature embryos as explants，and the medium composition was MS+1 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-1KT+6 g·L-1 agar or 7 g·L-1 phytagel.

Key words：Medicago falcata L.;Callus tissue;Mature embryo;Gelling agents

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.015

引用格式：

王树栓，张雨桐，石如如，等.野生黄花苜蓿胚性愈伤诱导研究［J］.草地学报，2024，32（7）：2143-2150

WANG Shu-shuan， ZHANG Yu-tong， SHI Ru-ru，et al.Study on Embryogenic Callus Induction of Wild Medicago falcata L.［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2143-2150

收稿日期：2023-12-25；修回日期：2024-03-02

基金项目：内蒙古自治区科技重大专项（2021ZD0031）；内蒙古自治区“揭榜挂帅”项目（2022JBGS0016）资助

作者简介：

王树栓（1998-），女，汉族，内蒙古锡林郭勒盟人，硕士研究生，主要从事牧草遗传育种研究，E-mail：wss980205@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：shifengling@imau.edu.cn

植物基因工程对于牧草品质的改良和新品种的选育具有十分重要的意义［1］，其中，组织培养技术被广泛应用于苜蓿抗性育种等方面的研究。苜蓿组织培养研究开展40多年来，我国学者对苜蓿的离体培养、遗传转化、体细胞杂交以及抗性材料筛选都进行了研究［2-4］，其中以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）报道居多。Walker等［5］报道了激素和培养基配方对不同基因型紫花苜蓿体外诱导的影响。Amini等［6］通过向体细胞胚培养基中添加菟丝子提取物来提高紫花苜蓿体细胞胚离体成熟、植株再生和转化效率。黄花苜蓿（Medicago falcata L.）的生态适应性和抗逆能力高于紫花苜蓿，同时具有丰富的遗传背景，是我国北方高寒地区改良苜蓿育成新品种重要的基因源［7］。此外，黄花苜蓿根系发达，具有较强的固氮能力，在生态修复以及防风固沙等方面也有重要的利用价值，是国内北方建设高产优质人工草地的首选［8］。苜蓿组织培养的外植体多为无菌苗的子叶和下胚轴，易出现培养周期长、培养条件相差较大和诱导率不一致等问题。刘芳等［8］从外植体和激素等方面探讨影响新疆野生黄花苜蓿愈伤诱导的因素，并利用遗传转化技术将含硫氨基酸AK-APR基因整合到黄花苜蓿基因组，成功得到转基因苗；李娟等［9］以下胚轴和子叶为外植体，优化培养流程后，新疆野生黄花苜蓿愈伤诱导率可达92%～95%，体胚发生率和体胚萌发成苗率也较高，再生周期约为70～80 d。成熟胚取材不限季节限制，诱导效率较高，且可以直接诱导体细胞胚，是苜蓿实现高效率遗传转化的可靠材料。黄花苜蓿遗传多样性丰富，不同品种间遗传差异较大［7］，因此不同品种或不同基因型间培养条件差异较大。本试验探讨了外植体、培养基、激素以及凝固剂对黄花苜蓿愈伤组织诱导的影响，以得到黄花苜蓿良好的胚性愈伤为目标，为黄花苜蓿诱变育种和基因工程技术的进一步发展提供一定的参考。

1" 材料与方法

1.1" 试验材料

试验材料为二倍体黄花苜蓿（Medicago falcata L.）种子，2019年采集于新疆地区，保存于内蒙古农业大学牧草种子实验室。

1.2" 试验方法

1.2.1" 种子预处理" 挑选成熟饱满的黄花苜蓿种子，用98%浓硫酸浸泡种子40 min，处理完毕后在流水下冲洗30～40 min，移入超净工作台用75%酒精震荡漂洗30 s，无菌水冲洗3～5次，然后用10%次氯酸钠（NaClO，有效氯浓度≥10%）浸泡30 min，再用无菌水冲洗6～7次。

1.2.2" 愈伤组织诱导" 将消毒种子分为两部分，一部分接种于1/2MS固体培养基上进行无菌苗培养，7 d后取无菌苗切取2 mm子叶和2～4 mm下胚轴为外植体接种于愈伤诱导培养基上；另一部分消毒种子用解剖针和镊子剥去种皮，将成熟胚接种至愈伤组织诱导培养基，培养条件为25℃，20 d暗培养10 d光照培养（光周期16 h·d-1，光照强度1 800～2 000 lx）。

1.2.3" 愈伤诱导及增殖培养基配置" 采用L9（34）正交试验设计（表1），设四因素三水平。以黄花苜蓿下胚轴、子叶和成熟胚为外植体，在 MS和N6培养基中分别添加不同浓度配比的2，4-D（1，2，3 mg·L-1）、KT（0.05，0.1，0.15 mg·L-1），以及水解酪蛋白（CH，0，1，2 g·L-1），每个培养基添加30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1琼脂，pH值5.8。

由上述试验筛选出诱导愈伤最佳的处理组合为培养基基本成分，进一步筛选不同凝固剂种类及浓度对愈伤组织诱导的影响。以成熟胚为外植体，愈伤组织诱导培养基基础成分为MS+2，4-D 1 mg·L-1+ KT 0.05 mg·L-1+ 30 g·L-1蔗糖，再分别添加琼脂（5，6，7，8 g·L-1）和植物凝胶（5，6，7，8 g·L-1）作为诱导培养基的凝固剂，pH值为5.8。培养条件为25℃暗培养。第21天统计愈伤组织诱导率和褐化程度，并将愈伤情况较好的胚性愈伤组织进行增殖培养，增殖培养基为MS+2，4-D 1 mg·L-1+ 30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂，pH值为5.8。上述MS和N6培养基均来自北京索莱宝科技有限公司，植物凝胶来自上海源叶生物科技有限公司，2，4-D和KT来自合肥博美生物科技有限公司，琼脂和蔗糖来自天津市大茂化学试剂厂，CH来自上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2.4" 统计方法" 愈伤诱导率=出愈外植体数/接种外植体数×100%；

褐化率=褐化面积gt;50%的外植体数/接种外植体数×100%。

1.2.5" 数据分析" 利用Microsoft Excel 2010 和GraphPad Prism 9进行基础数据整理和图形绘制，采用 SPSS 26.0进行数据方差分析。

2" 结果与分析

2.1" 愈伤组织诱导正交试验结果分析

如表1所示，各处理愈伤诱导情况差异较大，诱导率为15%～100%，褐化率最高达到95%，最低为11.9%。愈伤组织生长状态见图1：（Ⅰ）愈伤块表面湿润且结构紧密，质地为粘性，颜色为淡黄色或黄绿色，体积较大；（Ⅱ）愈伤块体积较小，表面干燥，白霜较多；（Ⅲ）多数外植体并未膨大，组织为干块状，生长缓慢；（Ⅳ）愈伤块较小，褐化较为严重。

第20 d观察各培养基愈伤块情况，发现以成熟胚为外植体的处理下褐化程度较低，基本不存在褐化，但以下胚轴和子叶为外植体的培养基中愈伤块体积较小，褐化数较多；培养至30 d，各培养基中褐化数增多，M1，M2和M3培养基中有部分胚状体出现绿色芽点。第30 d统计各处理愈伤诱导率和褐化率，发现M4～M6和N4～N6诱导率均为100%，但褐化率达62.5%～95.83%，大部分愈伤块呈黄褐色，其中以M4褐化率最高。综合来看，以成熟胚为外植体的培养基愈伤情况较好，诱导率较高且褐化率较低，愈伤块颜色呈浅黄色或黄绿色，生长量较大，培养20 d便可移入增殖培养基。图2为增殖培养两周后愈伤组织的生长状态，部分愈伤块可以直接分化出体细胞胚，出现类似球形或子叶型的胚状结构。

2.2" 不同培养基类型对愈伤组织诱导的影响

暗培养30 d后，从整体来看三种外植体在MS培养基上的愈伤诱导率较高，两者相差6.48%，MS培养基诱导愈伤组织的褐化率总体为51.92%，低于N6培养基（图3）。两种培养基诱导不同外植体的愈伤结果如图4所示，以下胚轴为外植体时，两种培养基的诱导率和褐化率差异不大，诱导率均为100%，但褐化情况较为严重；以成熟胚为外植体时，MS 培养基诱导率为91.47%，N6培养基诱导率为93.69%，N6培养下褐化率较高，为36.37%；子叶为外植体时，两种培养基愈伤情况差异较大，MS培养下的诱导率高于N6，两者相差21.67%，MS培养基中愈伤组织的褐化率为56.7%，N6培养基中为74.2%。

2.3" 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

三种外植体诱导愈伤组织的结果如图5所示，下胚轴为外植体的愈伤诱导率最高，为100%，显著高于子叶的愈伤诱导率（Plt;0.05），其次为成熟胚诱导的愈伤组织，出愈率为92.58%，显著高于子叶的愈伤诱导率（Plt;0.05）。三种外植体均存在褐化现象，以下胚轴诱导的愈伤块褐化现象最为严重，褐化率达到75.69%，大部分愈伤组织无法继续正常生长培养。子叶诱导的愈伤组织褐化率为65.42%，与下胚轴没有显著差异，愈伤组织多数为干块状，愈伤情况同样较差（表1）。成熟胚诱导的愈伤块褐化程度较轻，褐化率为28.85%，愈伤组织多数呈淡黄色，质地较粘，出现芽点较早。

2.4" 不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响

以成熟胚、下胚轴和子叶为外植体，接种至不同激素浓度的培养基中，愈伤组织的诱导率和褐化率见表2。以成熟胚为外植体，2，4-D和KT浓度分别为1 mg·L-1和0.05 mg·L-1时，胚性愈伤诱导率为95.24%，褐化率为19.05%，该处理下的胚性愈伤块诱导率较高且褐化率最低。在两种激素比值相同的情况下，愈伤组织褐化率随着激素浓度和CH含量的增高而增加；将下胚轴接种至含有不同浓度激素的培养基中，愈伤诱导率高达100%，但愈伤块的褐化程度显著高于以成熟胚为外植体时的处理（Plt;0.05），褐化率最高可达89.58%；以子叶为外植体时，诱导率显著低于其他处理（Plt;0.05），其中以添加1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1KT+2 g·L-1 CH时诱导率最低，愈伤诱导率随着2，4-D浓度的增加而增大，不添加CH时愈伤组织的褐化率最低。

2.5" 不同凝固剂对成熟胚愈伤组织诱导的结果

以成熟胚为外植体，接种至含有不同凝固剂的培养基中，各处理间的愈伤诱导率差异较小（表3）。凝固剂为琼脂时，Q7的诱导率显著低于其他处理（Plt;0.05），Q5和Q8处理的诱导率均为100%，其中Q6和Q8处理的褐化率较低（Plt;0.05）。此外，愈伤块均出现白霜现象，Q6和Q7培养基中的愈伤块白霜数较少；凝固剂为植物凝胶时，愈伤诱导率均为100%，但褐化率普遍较高，最高可达37.5%，显著高于以琼脂为凝固剂的各处理（Plt;0.05），Z7的褐化率和白霜数与其他处理相比较低；总体来看，Q6和Z7培养基中愈伤块生长情况较好，愈伤率高的同时，褐化率和白霜数较低。将生长情况较好的愈伤块移入增殖培养基，发现个别胚性愈伤组织出现直接分化体细胞胚的现象，并且在长时间内保持分化能力不发生褐化。

3" 讨论

3.1" 培养基类型对愈伤组织的影响

MS是组织培养中常见的培养基，适用于大多数双子叶植物，其特点是铵盐和硝酸盐的含量较高，能满足植物组织对矿质营养的要求。在黄花苜蓿的组织培养中，应用最广泛的也是MS培养基［10］。白静仁等［11］采用改良的MS培养基通过培养分化黄花苜蓿原生质体得到完整的再生植株，伊凤艳等［12］同样采用MS培养基，以下胚轴和子叶为外植体，探究不同激素配比对黄花苜蓿愈伤诱导及分化的影响，结果表明下胚轴诱导率可达100%，分化率达80%。B5培养基通常适用于单子叶植物，铵盐含量较低。Shao等［13］比较了MSH和B5两种转化再生体系，其中MSH通过直接体细胞胚胎发生来完成植株再生，使培养转化时间缩短为10～14周。

N6培养基最初主要应用于水稻等禾谷类作物的花药培养，目前在苜蓿组织培养和花药培养中也被广泛应用。本试验对比了MS和N6两种培养基对黄花苜蓿愈伤组织诱导的影响，发现MS培养基中愈伤组织的褐化率较低，以成熟胚和下胚轴为外植体时，两种培养基中愈伤组织的诱导率差异较小，诱导率可达91%～100%。N6培养基中含有丰富的N和K但不含钼，而MS培养基中的微量元素可为苜蓿提供生长发育所需的钼，为愈伤组织的生长提供更为全面的营养物质［9］，因此MS培养基更有利于苜蓿诱导胚性愈伤及愈伤组织分化成苗［14］。王红梅［15］以无菌苗子叶和下胚轴为外植体，采用MS为基础培养基，苜蓿愈伤诱导率高达100%，且愈伤组织生长情况良好。马海燕等［16］以三种苜蓿无菌苗的下胚轴为外植体，探究两种诱导培养基对愈伤组织诱导的影响，结果发现MS为诱导苜蓿愈伤有效的培养基。

3.2" 外植体种类对愈伤组织的影响

外植体的选择也是影响愈伤形成的重要因素，任何植物器官都具备发育成完整植株的能力，但再生能力存在差异。李波等［17］采用不同苜蓿的下胚轴、叶片、子叶和茎来探究不同品种间不同外植体愈伤诱导的结果，结果表明同一品种不同外植体的出愈率有明显差异，其中下胚轴诱导效果最佳，诱导率为99.4%，褐化率最低。温之雨等［18］利用紫花苜蓿的子叶为外植体建立了高频体细胞胚胎发生及成苗体系，利用该体系成功获得抗蚜转基因苜蓿。在苜蓿培养中，通常认为下胚轴是诱导胚性愈伤最佳的外植体，诱导率高并且出愈快，其次为子叶，是目前豆科牧草尤其是苜蓿愈伤诱导及再生体系建立中常用的外植体［19-20］。而国内关于苜蓿成熟胚诱导胚性愈伤的研究未见报道，成熟胚与其他外植体材料相比取材更容易，能够长期保存，并且不受季节和植株发育时期的限制，能够满足遗传转化研究工作中的大量重复性工作［21］。本研究发现，以成熟胚为外植体，黄花苜蓿愈伤组织的诱导率明显高于下胚轴和子叶，褐化程度较轻，且胚性持续时间长，可为黄花苜蓿的遗传转化工作提供新的思路。田娟等［22］探究了基因型、消毒方法以及培养基等条件对燕麦成熟胚胚性愈伤诱导的影响，结果表明添加低浓度的CH以及6 g·L-1的植物凝胶更有利于愈伤诱导；肖燕等［23］通过优化成熟胚诱导的组织培养配方，愈伤诱导率可达74%。

本研究发现，不同外植体下黄花苜蓿愈伤组织的出愈率和褐化率差异极大，以成熟胚为外植体的愈伤块不仅出愈快，而且愈伤组织生长发育情况较好，与下胚轴和子叶相比成熟胚诱导的愈伤块体积更大，褐化程度较轻，更适用于黄花苜蓿胚性愈伤的诱导和后续体细胞胚的发生，成熟胚培养技术也被应用于植物合成同源多倍体的研究，并且可能会扩大相同重复基因组的表型变异，为新品种的选育创造机会［24］。

3.3" 激素浓度对愈伤组织的影响

生长调节剂的种类和浓度也是影响愈伤形成的重要因素，激素配比以及浓度的变化会引起植物愈伤组织诱导效率的差异［25］。李望丰等［26］筛选了对2，4-D敏感，并且体胚发生效率高和分化高的苜蓿品种，进一步完善了苜蓿再生体系，对于苜蓿的遗传转化研究具有重大意义。赵晓倩［27］利用甘农四号紫花苜蓿的不同外植体，探究不同浓度2，4-D对愈伤组织诱导的影响，结果表明添加不同质量2，4-D的培养基上的愈伤组织诱导率差异不显著，诱导率均达到90%以上。徐舶等［28］研究表明诱导呼伦贝尔黄花苜蓿花药愈伤形成的最佳培养基为B5培养基+0.5 mg·L-1 2，4-D+0.25 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1 NAA+3.0 mg·L-1KT。有报道称，适量浓度的2，4-D才会增加植物的愈伤诱导率，而过低或过高的剂量对愈伤形成是不利的［29］。在豆科牧草组织培养的研究中，同样认为2，4-D在诱导胚性愈伤过程中是不可缺少的，其与KT的配合使用更有利于胚性愈伤的生长和体细胞胚的形成［30］。康红霞等［31］研究表明，NAA（萘乙酸）对红豆草愈伤诱导的影响程度大于ZT（玉米素）和6-BA。本试验在培养基中添加了不同浓度和配比的2，4-D和KT，观察到添加适量的2，4-D对于黄花苜蓿胚性愈伤的诱导是十分有利的，以成熟胚为外植体时低剂量的2，4-D与低剂量的KT搭配使用愈伤诱导率可达95.24%，随着激素浓度的升高，但比值不变的情况下，诱导率在逐渐下降，而褐化率随着升高。而以下胚轴和子叶为外植体时，随着2，4-D浓度的增高，褐化率在逐渐减小。侯永霞等［31］研究表明，MS培养基中添加1 mg·L-1 2，4-D+0.4 mg·L-1 6-BA，黄花苜蓿子叶和下胚轴的诱导率可达100%，愈伤状态也较好，而随着2，4-D浓度的增大，愈伤组织褐化程度加重。因此，激素种类以及外植体类型是影响愈伤诱导率和褐化率的重要原因。

CH广泛应用于苜蓿花药培养的研究中，对于花药愈伤的质量和愈伤分化具有良好的促进作用［32，33］。靳慧卿等［4］研究表明添加1 g·L-1CH有利于提高‘中苜2号’和‘草原3号’的体胚发生率。不添加CH的培养基中愈伤组织生长状况较好，而高剂量的愈伤诱导率有降低趋势，这可能是因为CH对黄花苜蓿愈伤诱导的影响较小，使用浓度过高反而存在抑制作用。

3.4" 凝固剂对成熟胚愈伤组织的影响

固体培养基通常使用凝固剂使培养基在常温下凝固，也可以吸附某些代谢有害物质，凝固剂能够直接影响培养基的通透性。在苜蓿组织培养中最常用的凝固剂为琼脂，通常用量在0.6%～0.8%。此外，植物凝胶Phytagel和Gelrite也被广泛应用于植物组织培养，并有研究表明Phytagel和Gelrite在愈伤组织诱导方面优于琼脂［34-35］。黄花苜蓿愈伤诱导培养基中添加0.6%琼脂和0.7%植物凝胶均有利于成熟胚的愈伤诱导，愈伤块的生长状况优于其他处理。

4" 结论

本试验成功筛选得到适用黄花苜蓿胚性愈伤诱导的最佳诱导培养基，即以成熟胚为外植体，培养基成分为MS+1 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-1KT+6 g·L-1琼脂或7 g·L-1植物凝胶，该处理下愈伤块表现最佳，表面湿润，质地为粘性且愈伤组织体积较大。

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（责任编辑" 彭露茜）