不同外植体和植物激素对大蒜愈伤组织诱导的影响

孔素萍+杜红霞+杨妍妍+霍雨猛+高莉敏+刘冰江+缪军+吴雄

摘 要：以大蒜鳞芽基部、茎尖、根尖和试管苗叶片为外植体，研究不同激素配比对大蒜愈伤组织诱导的影响。结果表明：大蒜根尖和鳞芽基部比茎尖和试管苗叶片易于诱导愈伤组织，根尖愈伤组织诱导率最高。不同激素配比对4种外植体愈伤组织诱导的影响不同，根尖在6-BA和2，4-D不同激素配比下全部诱导出愈伤组织；鳞芽基部愈伤组织诱导的最适激素组合为0.3 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L 2，4-D或0.5 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D，诱导率为100%；茎尖愈伤组织诱导的最适激素配比为0.7 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D，诱导率为85.83%；试管苗叶片愈伤组织诱导的最适激素配比为0.3 mg/L 6-BA + 2.0 mg/L 2，4-D，诱导率为71.67%。

关键词：大蒜；外植体；植物激素配比；愈伤组织

中图分类号：S633.404+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）12-0020-05

Abstract The effects of different plant hormones on the callus induction of garlic were studied by using the base of clove， shoot tips， root tips and leaves of in vitro plantlet as explants in this study. The results showed that root tips and the base of clove were easier to induce callus than shoot tips and leaves of in vitro plantlet. And the callus induction rate of root tips was the highest in the four kinds of explants. Different plant hormone combinations had different effects on the four kinds of explants. The calli were induced from root tips in all combination of 6-BA and 2，4-D. The callus induction rate of the base of clove was 100% in the combination of 0.3 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D， or 0.5 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D. The callus induction rate of shoot tips was 85.83% in the best combination of 0.7 mg/L 6-BA and 1.5 mg/L 2，4-D. The combination of 0.3 mg/L 6-BA and 2.0 mg/L 2，4-D was the best for leaves of in vitro plantlet to induce callus， and the rate of callus induction was 71.67%.

Keywords Garlic； Explant； Plant hormone combination；Callus

大蒜（Allium sativum L.）为百合科（Liliacaea）葱属（Allium）植物，常年用鳞茎进行无性繁殖，繁殖系数较低，愈伤组织途径是解决此问题的有效手段之一[1-3]。目前，用于大蒜愈伤组织途径植株再生的外植体主要有茎尖[4，5]、根[6，7]、叶片[8]、鳞茎盘[9]、花器官[10]等。植物生长调节剂对大蒜愈伤组织诱导起着重要作用[11]，高山林等[12]以MS为基本培养基，诱导茎尖分生组织产生愈伤组织的最适激素配比为0.2 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；裴雁曦等[13]研究了2，4-D、NAA和6-BA三种激素与愈伤组织诱导率之间的回归方程，通过模拟推测得出，愈伤组织最佳诱导培养基为MS+0.98～1.14 mg/L 2，4-D+0.93～1.09 mg/L NAA+1.19～1.36 mg/L 6-BA；李转春等[14]在利用大蒜发芽叶诱导愈伤组织时发现，需要在生长素和细胞分裂素共同作用下才能获得最佳愈伤组织诱导效果。不同植物激素配比对同种植物不同部位外植体的愈伤组织诱导影响不同[15-17]，王瑞等[18]报道，油茶叶片、茎段诱导愈伤组织的最佳激素组合为0.5 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L KT，茎尖诱导愈伤组织的最佳激素配比为0.5 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L KT；3种外植体中，叶片最容易诱导愈伤组织，诱导率可达100%。但目前不同激素配比对大蒜不同外植体愈伤组织诱导的影响鲜见报道。本试验以大蒜不同部位为外植体，研究不同激素配比对不同外植体愈伤组织诱导的影响，旨在筛选出大蒜愈伤组织诱导的最佳条件，为大蒜植株再生体系的建立奠定基础，为进一步完善大蒜的快繁体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培养方法

选用兰陵县大蒜品种‘蒲棵为材料，取材时期为鳞茎自然晾干并通过休眠。外植体分别为鳞芽基部、茎尖、根尖、试管苗叶片：取健康的鳞芽，去皮后经自来水冲洗0.5 h，在无菌条件下依次用75%乙醇消毒1 min、0.1%次氯酸钠溶液消毒3 min，再用无菌水冲洗3遍。切取鳞芽基部2 mm左右作为外植体，将其按十字状纵切为四份，接种在愈伤组织诱导培养基上；经过消毒的鳞芽，在无菌条件下剥离出0.2 mm左右带2个叶原基的茎尖作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上，剥离茎尖时用解剖针顺茎尖生长的方向垂直扎两针；根尖取自生根试管苗，当在无激素培养基上生长的生根试管苗根长至1.5～2.0 cm时，在无菌条件下，取0.5～1.0 cm带根尖的根段进行愈伤组织诱导；试管苗叶片取自利用茎尖在无激素培养基上生成的试管苗，当试管苗长至4片叶左右时，在无菌条件下用剪刀将基部第二片叶剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，用于愈伤组织的诱导。

1.2 试验设计

诱导愈伤组织的基本培养基为B5培养基，其中含蔗糖30 g/L，琼脂粉6 g/L，pH值5.8～6.0。试验采用裂区设计，主区因素A为外植体类型（鳞芽基部、茎尖、根尖、试管苗叶片），裂区因素B和C分别为6-BA、2，4-D，各设3个水平：6-BA分别为0.3、0.5、0.7 mg/L，2，4-D分别为1.0、1.5、2.0 mg/L。每个处理接种60个外植体，分为3组，作为3次重复。经60 d培养后调查不同外植体愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率（%）=产生愈伤组织外植体数/接种外植体总数×100。

1.3 培养条件

培养室温度（23.0±2.0）℃，光强25～31 μmol·m-2·s-1、光周期16 h/d。

1.4 数据统计

采用DPS软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同外植体对愈伤组织形成的影响

不同外植体的愈伤组织诱导发生时间不同，根尖和茎尖愈伤组织形成较快，20 d左右愈伤组织开始形成；其次是试管苗叶片，愈伤组织形成时间为22 d；鳞芽基部愈伤组织形成最慢，约需25 d。不同外植体形成的愈伤组织颜色也有差别（见图1），鳞芽基部、根尖和茎尖愈伤组织主要为淡黄色，而试管苗叶片愈伤组织主要为淡绿色，4个外植体均形成质地疏松的愈伤组织。

2.2 不同外植体和植物激素配比对愈伤组织诱导的影响

在6-BA和2，4-D不同配比条件下，各种外植体对愈伤组织诱导的影响具有显著差异，由表1可知，根尖易于形成愈伤组织，不同6-BA和2，4-D配比下均全部诱导出愈伤组织；鳞芽基部、茎尖和试管苗叶片在不同激素配比下愈伤组织诱导率具有显著差异，当2，4-D为1.5 mg/L和2.0 mg/L时，鳞芽基部愈伤组织诱导率达90%以上，在0.3 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D配比下，愈伤组织诱导率为100%；当6-BA为 0.7 mg/L、2，4-D为1.5 mg/L时，茎尖愈伤组织诱导率最高，为85.83%；试管苗叶片愈伤组织诱导率最高为71.67%，在6-BA和2，4-D分别为0.3、2.0 mg/L时获得。

2.3 不同因素愈伤组织诱导率的方差分析

方差分析结果（表2）表明，外植体类型、6-BA和2，4-D不同水平间愈伤组织诱导率差异均达到极显著水平，且因素间的交互作用也均达到了极显著水平，说明这三个因素及其交互作用对大蒜愈伤组织诱导具有极显著影响。

2.4 不同因素愈伤组织诱导率的多重比较

对不同因素愈伤组织诱导率进行多重比较，结果（表3）表明，外植体类型中，根尖愈伤组织诱导率最高，为100%，极显著高于其它外植体；其次是鳞芽基部，愈伤组织诱导率为92.5%；而试管苗叶片愈伤组织诱导率最低，为41.30%。因此，根尖和鳞芽基部是诱导愈伤组织比较理想的外植体。

因素6-BA随着其浓度的增加，愈伤组织诱导率降低，0.3 mg/L和0.5 mg/L的愈伤组织诱导率极显著高于0.7 mg/L的；因素2，4-D在1.5 mg/L时愈伤组织诱导率较高，极显著高于高浓度和低浓度处理下的愈伤组织诱导率。

3 讨论与结论

3.1 外植体类型对大蒜愈伤组织诱导的影响

外植体的选择是愈伤组织诱导的关键步骤[19，20]。李云玲等[21]研究表明，紫花苜蓿子叶和下胚轴在相同培养基MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.5 mg/L BA上，下胚轴的愈伤组织诱导率高于子叶。李文静等[22]选取野生荠菜下胚轴、子叶、真叶和叶柄作为外植体，结果表明下胚轴出愈率最好。苏江等[23]研究表明岩黄连不同外植体在愈伤组织诱导上存在较大差异，叶柄和叶片愈伤组织诱导率明显高于茎尖和茎节，且叶片愈伤组织诱导率最高。本研究结果同样表明，不同类型外植体诱导愈伤组织的难易程度不同，大蒜根尖和鳞芽基部比茎尖和试管苗叶片诱导愈伤组织能力强，愈伤组织诱导率极显著高于后两者。

3.2 不同植物激素对大蒜愈伤组织诱导的影响

许多研究表明，影响愈伤组织诱导最大的因素是外源生长素和细胞分裂素浓度以及两者之间的配比[24，25]，且外植体材料不同，诱导愈伤组织的适宜激素浓度不同[27，28]。李志勇等[26]研究表明，以MS为基本培养基，3.0 mg/L 2，4-D + 2.2 mg/L IBA的激素配比可促使广州白皮蒜瓣愈伤组织大量发生。贾晓梅等[29]报道，0.3 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA为贴梗海棠茎段诱导愈伤组织的最适激素配比，而0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA为叶片诱导愈伤组织的最适激素配比。曲静等[30]研究表明，以MS为基本培养基，诱导辣椒茎段愈伤组织生成的最佳激素组合为0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA，而诱导辣椒子叶愈伤组织生成的最佳激素组合为0.1 mg/L 6-BA+4.0 mg/L NAA。栾非时等[4，10]研究了2，4-D与BA配比对大蒜茎尖和花原始体愈伤组织诱导和生长的影响，结果表明，茎尖愈伤组织诱导最佳激素组合为2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L BA，花原始体愈伤组织诱导的最佳激素配比为0.05 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L BA。本研究结果也表明，根尖在6-BA和2，4-D不同配比下全部诱导出愈伤组织；鳞芽基部愈伤组织诱导的最适激素组合为0.3 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2，4-D或0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D，愈伤组织诱导率为100%；茎尖愈伤组织诱导的最适激素配比为0.7 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D，茎尖愈伤组织诱导率为85.83%；试管苗叶片愈伤组织诱导的最适激素配比为0.3 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D，愈伤组织诱导率为71.67%。

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