大白菜种质资源抗根肿病基因CRa和CRb的分子标记鉴定与分析

孙朝辉+马安峰+曹丹丹+程斐+高建伟

摘 要：大白菜根肿病是一种严重影响大白菜生长的土传病害，已成为大白菜重要病害之一。CRa和CRb是大白菜抗根肿病的两个重要基因。本研究对已发表的4个CRa分子标记进行筛选，选出1对与CRa基因紧密连锁的标记，包括抗病基因标记SC2930-T和感病基因标记SC2930-Q。利用该CRa基因标记和已经验证的CRb基因标记TCR05对24份推广或拟推广大白菜品种进行筛选，选出同时具有CRa与CRb基因的品种12份，只有CRa基因、没有CRb基因的品种5份，只有CRb基因、没有CRa基因的品种3份，CRa与CRb基因均不含有的品种4份，表明CRa与CRb基因均为独立遗传的显性抗性基因。本研究对大白菜抗根肿病分子标记辅助育种具有重要的参考价值。

关键词：大白菜；种质资源；根肿病；CRa与CRb；分子标记

中图分类号：S634.1+Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）12-0016-05

Abstract Clubroot disease is one of the most serious diseases of Chinese cabbage （Brassica rapa） caused by the soil-borne plant pathogen Plasmodiophora brassicae. CRa and CRb are the two important genes against to clubroot disease in Chinese cabbage breeding. In this research， we selected a pair of effective SCAR makers SC2930-T and SC2930-Q to detect CRa gene from four published candidates. Depending on this pair of markers and another effective codominant marker TCR05 closely linked to CRb gene， 12 varieties both with CRa and CRb genes， 5 varieties only with CRa gene， 3 varieties only with CRb gene and 4 varieties with neither CRa nor CRb genes were screened out from 24 important Chinese cabbage varieties. This research results showed that both CRa and CRb were independent dominant genes resistant to clubroot disease in Chinese cabbage. This research had great reference values for molecular marker assisted breeding of Chinese cabbage resistant to clubroot disease.

Keywords Chinese cabbage； Germplasm resources； Clubroot disease； CRa and CRb； Molecular markers

大白菜根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的土传性病害，严重危害十字花科蔬菜的生产。在我国云南、四川、山东等地，大白菜根肿病发生面积已经超过种植面积的65%，部分田块的损失超过50%，严重制约大白菜的生产[1]。实践证明，培育抗根肿病品种是防治大白菜根肿病的重要措施。迄今为止，在亚洲芸薹种中尚未鉴定出十字花科根肿病抗性种质，大白菜根肿病抗源均来源于地中海43份CR芜菁品系，表现出高抗甚至免疫[2]。目前在大白菜上已经鉴定出8个与抗根肿病有关的基因位点，包括位于A03染色体上的CRa、CRb、CRk和Crr3，以及分别位于A08、A01、A06、A02染色体上的Crr1、Crr2、Crr4和CRC[3-7]。CRa、CRb是两个重要的抗根肿病基因，但目前国内利用分子标记对大白菜种质资源中这两个基因进行鉴定的研究报道不多，限制其育种进程。本研究对国外已发表的4个CRa标记进行筛选，并利用筛选出的CRa标记和我们已经验证的CRb标记对来源于国内外的24份重要大白菜种质资源进行鉴定，并对CRa和CRb两个基因的连锁关系进行分析，以期为大白菜抗根肿病育种提供高质量的抗性种质资源和准确便捷的辅助鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大白菜品种共24个（表1），其中1号为对照，是青岛地区主栽品种87-114，其余均为国内外公司最近几年已经推广或正在测试的抗根肿病品种。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取及PCR扩增条件 取5叶1心期幼嫩的大白菜内叶为试材，DNA提取方法参照Williamson等[8]的CTAB法。

PCR反应总体积为20 μL：在48孔PCR板中分别加入PCR Master Mix （2×） 10 μL，上游引物和下游引物（10 U/μL）各1 μL，50 ng/μL模板DNA 2 μL，ddH2O补齐至20 μL。

PCR的反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，55℃退火1.5 min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃重延伸10 min，4℃保存。

PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶、电压5 V/cm条件下电泳1 h，用Goodview染色，Bio-RAD凝胶成像系统成像，观察并保留结果。

上述试验所用试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 抗根肿病基因CRa分子标记验证与种质资源筛选 利用已发表的4个SCAR标记（表2）对24份大白菜种质资源基因组DNA进行PCR扩增，筛选出与CRa基因紧密连锁的标记，同时对种质资源中的CRa基因进行鉴定。

1.2.3 种质资源抗根肿病基因CRb的鉴定 采用已验证的CRb基因SCAR标记TCR05对24份大白菜种质资源基因组DNA进行PCR扩增，对种质资源中的CRb基因进行鉴定。TCR05序列，F：5′-AGAATCATGACCGGGGAAAT-3′；R：5′-GCAGCTAAGTCATCGACCAA-3′。

1.2.4 大白菜抗病性鉴定 将采自青岛崂山区根肿病发病严重的大白菜病根洗净后加入适量的水，用粉碎机磨碎呈匀浆，四层纱布过滤，冷冻离心机4 000 r/min离心10 min，弃上清，用蒸馏水悬浮沉淀，共重复3次后弃上清，用蒸馏水将悬浮液孢子浓度调至2×108个/mL，4℃保存备用[9]。

大白菜种质资源种子催芽后播于穴盘中。穴盘中所用基质为品氏进口草炭，用前经过高温灭菌。播种前将每穴下压成0.5 cm的凹槽，用移液器吸取菌液5 mL注射底部，并将催芽的种子播入其中，覆盖好。试验设3个重复，每个重复每份种质资源播25穴，随机排列。播种后，放置在日光温室中培养。日光温室白天温度为20～28℃，夜间为12～20℃。待苗长到3～4片真叶时定苗，每穴留一株。35天后将植株取出，洗净根部泥土，调查记录，主根和侧根都无肿瘤记为抗病，只要在主根、侧根或须根出现肿瘤，不分大小均记为感病。

2 结果与分析

2.1 抗病基因CRa分子标记验证与种质资源抗病性鉴定

利用与CRa连锁的4对分子标记在24份大白菜种质资源中进行扩增，其中3对引物HC352-2、HC352b7和HC352b16的扩增结果与对照感病品种相比未表现多态性和差异性。只有抗病基因标记SC2930-T和感病基因标记SC2930-Q表现多态性。抗病基因标记SC2930-T在17份种质资源中扩增出800 bp的特异性片段，感病基因标记SC2930-Q在14份种质资源中也扩增出800 bp的特异性片段。

从图1和图2可以看出，种质资源1、2、5、7、8、17、19没有标记出抗病基因位点，而标记出感病基因位点，因此不含抗病基因CRa；9、10、11、14、16、18、20、22、24标记出抗病基因位点，而没有标记出感病基因位点，因此抗病基因CRa等位基因是纯合的；3、4、6、12、13、15、21、23既标记出抗病基因位点，又标记出感病基因位点，因此抗病基因CRa的等位基因是杂合的。

从表3可以看出，含有CRa抗病基因的种质资源，无论是纯合还是杂合，人工接种的结果都表现为抗病，说明CRa抗病基因是一个显性基因。在不含有CRa抗病基因的种质资源中，1、7表现为感病，2、5、8、17、19表现为抗病。

2.2 种质资源CRb抗病基因的筛选与抗病性鉴定

利用SCAR标记TCR05在24份大白菜种质资源中进行扩增，对抗病基因CRb进行鉴定。从图3可以看出，4、9、12、16、24均只扩增出一条279 bp的片段，表明含有等位基因纯合的抗病基因CRb；2、3、8、11、13、14、18、19、21、22均扩增出279、250 bp两条片段，表明含有等位基因杂合的抗病基因CRb；1、5、6、7、10、15、17、20、23均只扩增出一条250 bp的片段，表明不含抗病基因CRb。

从表4可以看出，含有CRb抗病基因的种质资源，无论抗病基因位点是纯合还是杂合，人工接种的结果都表现为抗病，说明CRb抗病基因也是一个显性基因。在不含有CRb抗病基因的种质资源中，5、6、10、15、17、20、23表现为抗病，1、7表现为感病。在既不含有CRa基因也不含有CRb基因的4份种质资源中，5、17表现抗病，1、7表现感病。

3 讨论与结论

利用CRa的抗病基因标记SC2930-T和感病基因标记SC2930-Q经过两次扩增，鉴定出种质资源中CRa基因是否存在及其纯杂性的分子标记结果与人工接种结果一致，因此，SC2930-T和SC2930-Q是CRa基因的一对有效标记。

本试验结果表明，在大白菜种质资源中，CRa和CRb基因只要有一个存在，且无论等位基因是纯合还是杂合的，对来源于青岛崂山区的大白菜根肿病都有抗性，说明CRa和CRb基因均属于显性主效基因。这一结果与Piao等[10]在芸薹属其他作物中的研究结果一致。因本试验做的是苗期试验，感染根肿病的幼苗之间根系差异不如成株差异明显，无法准确评价CRa单独存在、CRb单独存在、CRa与CRb共同存在时的抗病性差异，下一步应该对CRa、CRb的抗性差异和CRa与CRb的互作效应做深入研究。

Diederichsen等[11]提出 CRa与CRb可能是等位基因或紧密连锁的2个抗病位点。本试验24个大白菜品种中，同时具有CRa与CRb基因的品种12份，只有CRa基因、没有CRb基因的品种5份，只有CRb基因、没有CRa基因的品种3份，CRa与CRb基因均不含有的品种4份。CRa与CRb基因表现为独立遗传，与以往研究结果不一致。可能是在大白菜与欧洲芜菁多代杂交以及抗根肿病大白菜种质与非抗种质长期杂交过程中染色体交换引起的，真正原因有待进一步研究。

在4份均不含CRa与CRb基因的大白菜品种中，有两份仍然表现为抗根肿病，而且均来源于国内，这一试验结果与杨征等[12]用其他引物标记的结果一致。这是否暗示有新的抗源出现，有待进一步验证。

参 考 文 献：

[1] 王靖，黄云，李小兰. 十字花科根肿病研究进展[J].植物保护，2011，36（6）：153-158.

[2] Yoshikawa H. Studies on breeding of clubroot resistance in cole crops[C]// Bull. Natl. Res. Inst. Veg. Ornam. Plants Tea Jpn. Ser. A.，1993，7：1-165.

[3] Sakamoto K， Saito A， Hayashida N， et al. Mapping of isolate-specific QTL for clubroot resistance in Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）[J]. Theor. Appl. Genet.，2008， 117（5）：759-767.

[4] Suwabe K， Tsukazaki H， Iketani H， et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana： the genetic origin of clubroot resistance[J].Genetics， 2006， 173（1）：309-319.

[5] Hirai M， Harada T， Kubo N， et al. A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage markers[J]. Theor. Appl. Genet.，2004， 108（4）：639-643.

[6] Piao Z Y， DengY Q， Choi S R， et al. SCAR and CAPS mapping of CRb， a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis） [J]. Theor. Appl. Genet.， 2004， 108（4）：1458-1465.

[7] Suwabe K， Tsukazaki H， Iketani H， et al. Identification of two loci for resistance to clubroot （Plasmodiophora brassicae Woronin） in Brassica rapa L.[J]. Theor. Appl. Genet.， 2003， 107 （6）：997-1002.

[8] Williamson V M， Ho J Y， Wu F F， et al.A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi， in tomato [J]. Theoretical and Applied Genetics，1994，87（7）：757-763.

[9] 张淑霞，杨晓云，司朝光，等.大白菜根肿病人工接种鉴定方法比较[J]. 山东农业科学，2010（1）：78-79.

[10]Piao Z Y，Ramchiary N， Lim Y P. Genetics of clubroot resistance in Brassica species[J]. Plant Growth Regul.，2009，28：252-264.

[11]Diederichsen E，Frauen M，Linders E A，et al. Status and perspectives of clubroot resistance breeding in crucifer crop[J]. Journal of Plant Growth Regulation，2009，28（3）：265-281.

[12]杨征，杨晓云，张清霞，等. 大白菜抗根肿病基因位点CRa和CRb的分子标记鉴定[J]. 华北农学报， 2015，30（2）：87-92.