4种油麻藤属植物的种子灭菌研究

林茂 李进华 唐庆

摘 要：为优化油麻藤属植物的种子灭菌方式，筛选油麻藤属种子最佳的灭菌方式，为其组培快繁技术的建立提供基础。以4种油麻藤属植物的种子为外植体，以酒精、次氯酸钠、升汞的浸泡时间为三因素，通过三因素三水平的正交试验，筛选出油麻藤外植体的最佳灭菌方式。结果表明：美叶油麻藤灭菌的最优处理为酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞10～15 min;白花油麻藤滅菌的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10～15 min，再用升汞15 min;大果油麻藤获低污染率的最优组合是酒精40 s后次氯酸钠15 min，再用升汞10 min，获高萌发数的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞15 min;常春油麻藤获低污染率的最优组合是酒精40 s后次氯酸钠15 min，再用升汞10 min，获高萌发数的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞10 min。结果表明不同种的油麻藤属植物的种子灭菌最优组合有所不同。

关键词：油麻藤属;外植体;正交试验;灭菌

中图分类号：S 72 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）10-007

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.007

Abstract： In order to optimize the sterilization method of the seeds of Mucuna plants， the best sterilization method of the seeds of Mucuna plants was screened to provide the basis for the establishment of the tissue culture rapid propagation technology. Taking the seeds of four kinds of Mucuna plants as explants and the soaking time of alcohol， sodium hypochlorite and mercury bichloride as three factors， the best sterilization method of Mucuna explants was selected through the orthogonal test of three factors and three levels. The results showed that the optimal treatment for the sterilization of Mucuna calophylla was 60 s of alcohol followed by 10 min of sodium hypochlorite and then 10-15 min of mercury bichloride. The optimal treatment for the sterilization of Mucuna birdwoodiana Tutcher was 60 s of alcohol followed by 10-15 min of sodium hypochlorite and then 15 min of mercury bichloride. The optimal combination for the low pollution rate of Mucuna macrocarpa was sodium hypochlorite for 15 min after 40 s of alcohol and then mercury bichloride for 10 min， while the optimal combination for the high germination number was sodium hypochlorite for 10 min after 60 s of alcohol and then mercury bichloride for 15 min. The optimal combination for the low pollution rate of Mucuna sempervirens was sodium hypochlorite for 15 min after 40 s of alcohol and then mercury bichloride for 10 min， while the optimal combination for the high germination number was sodium hypochlorite for 10 min after 60 s of alcohol and then mercury bichloride for 10 min. The results showed that the optimal combinations of seed sterilization were different in different species of Mucuna plants.

Key words： Mucuna; Explant; Orthogonal test; Sterilization

油麻藤属植物主要分布在我国的热带和亚热带地区，约有15种，资源极其丰富[1]。该属植物具有适应性强、生长快的优点，同时还兼具较高的观赏价值和重要的药用价值[2-4]，应用前景广阔。随着市场对油麻藤属种苗需求的增加，加快优质种苗的生产变得尤为重要。组培快繁的繁殖系数高、周期短、不受季节和气候条件的限制，是种苗规模化生产的有效途径。油麻藤属植物为木本植物，通过茎段、叶片等为外植体来建立快繁体系存在较大难度，通过种子无菌萌发来建立快繁体系则相对容易。种子灭菌是组培快繁的第一步，灭菌效果的好坏直接影响着下一步进程。因此，开展油麻藤属植物的种子灭菌研究极具实践意义，可为组培快繁的建立提供理论依据和技术支持。

目前关于油麻藤属植物的研究主要集中在地理分布[5]、栽培[6-7]、资源开发应用[8-9]以及人工繁殖[10-12]上，而关于其组培快繁的研究报道较少，仅有游云飞[13]进行了研究，并以不同月份采集的不同成熟程度的荚果种子为外植体成功建立了离体再生体系。虽然已有许多植物的组织培养的相关报道，但关于外植体灭菌的研究并不多，通过正交试验设计进行的外植体灭菌研究就更少了。目前，已有土沉香[14]、大花序桉[15]、番茄[16]、云南甜龙竹、黄竹[17]的外植体灭菌是通过正交试验设计的方法获得的。正交试验设计在油麻藤属植物的种子灭菌未见有报道。虽已有游云飞[13]进行了常春油麻藤的离体再生体系研究，但其种子灭菌处理为单因素试验。正交试验设计能更高效率、快速、经济地筛选出最优组合，有利于建立油麻藤属植物的组培快繁体系，以实现其优质种苗的规模生产。为探讨油麻藤属植物种子灭菌的最佳处理方式，本试验以4种油麻藤属植物的种子为外植体，以酒精、次氯酸钠、升汞为因素，以其不同的浸泡时间为因素水平，通过三因素三水平的正交试验设计，筛选出4种油麻藤属植物的种子最佳灭菌方式，为其组培快繁体系的建立以及今后的遗传转化研究提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的4种油麻藤分别为美叶油麻藤、白花油麻藤、大果油麻藤、常春油麻藤，种子均由广西壮族自治区林业科学研究院提供。材料选择籽粒饱满、大小均匀的种子（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 采用L9（34）正交表，以3种不同灭菌剂为试验因素、灭菌剂的浸泡时间为因素水平（表2），按照表3的处理进行试验，每个处理的种子数为15粒，重复3次。研究各因素对种子灭菌成活以及萌发的影响，并对结果进行多重比较、极差、方差分析，以确定油麻藤种子灭菌的最优条件。

1.2.2 灭菌操作 将种子在中性洗涤剂中浸泡10～15 min后，在自来水下冲洗30 min。灭菌操作过程在超净工作台上进行。按照表2的处理方式进行种子灭菌：将种子在消毒剂A中浸泡一定的时间，无菌水冲洗3遍;然后在消毒剂B中浸泡一定的时间，无菌水冲洗3遍;再在消毒剂C中浸泡一定的时间，无菌水冲洗3遍。最后接入MS培养基中，在温度23～25℃的条件下进行暗培养。每天观察种子的污染、萌发情况，连续观察15 d，最后统计污染数、成活数、萌发数，并计算污染率。

污染率（%）=污染种子数/接种数×100

1.3 统计分析

数据用Excel 2003统计处理，方差分析及Duncan′s多重比较采用SPSS 19.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同处理对4种油麻藤种子灭菌效果的影响

从表4可以看出，不同种类中不同处理的灭菌效果有所不同。在美叶油麻藤中，处理7的污染率显著低于处理1和处理6，但与其他处理无显著差异;处理7的萌发数仅次于处理2的萌发数，两者无显著差异。在白花油麻藤、大果油麻藤中，处理9的污染率最低，但萌发数并不是最高的，白花油麻藤的萌发数与其他8个处理无显著差异，大果油麻藤的萌发数与除处理1外的其余7个处理无显著差异。在常春油麻藤中，处理4的污染率最低，萌发数以处理7的最多，但与其余8个处理的萌发数无显著差异。由上可知，在正交试验的9个处理中，不同油麻藤属植物的种子污染率、萌发数各不相同。

2.2 试验的方差分析

通过表5的方差分析可知，不同灭菌剂对4种油麻藤属植物种子灭菌影响如下：在美叶油麻藤、白花油麻藤、大果油麻藤中，仅有升汞对污染率、萌发数存在显著差异，而酒精和次氯酸钠对这3种油麻藤的污染率、萌发数无显著差异;在常春油麻藤中，升汞对污染率的影响存在显著差异，对萌发数的影响无显著差异，酒精和次氯酸钠对常春油麻藤的污染率、萌发数均无显著差异。由此可知，酒精和次氯酸钠对4种油麻藤的污染率、萌发数的影响不大;升汞对4种油麻藤的污染率的影响较大，在萌发数的影响上，除了对常春油麻藤的影响不大外，对其余3种的萌发数均有显著影响。

2.3 各因素的多重比较

通过表6的各因素多重比较分析可知，在5%的显著水平上，不论哪一种油麻藤，酒精、次氯酸钠的各水平对污染率、萌发数均无显著影响，仅有升汞的影响显著。升汞对4种油麻藤污染率的影响趋势一致，在污染率上，水平1显著高于水平2和水平3，水平2和水平3无显著差异。在萌发数上，升汞的影响因物种不同而不同：在美叶油麻藤、大果油麻藤中，水平1显著低于水平2和水平3，水平2和水平3无显著差异，其中美叶油麻藤水平2的萌发数最多，大果油麻藤水平3的萌发数最多;在白花油麻藤中，水平1显著低于水平3，水平2和水平3无显著差异;在常春油麻藤中，3个水平无显著差异。由上可知，升汞对灭菌效果的影响大于酒精和次氯酸钠。

2.4 各因素主次效应分析

极差的大小反映了因素对测定指标影响的大小，值越大则表明该因素越重要。通过表7的极差分析可知，在美叶油麻藤中，各因素对污染率影响的主次水平为升汞>酒精>次氯酸钠，对萌发数影响的主次水平为升汞>次氯酸钠>酒精。在白花油麻藤、大果油麻藤和常春油麻藤中，各因素对污染率影响的主次水平均为升汞>次氯酸钠>酒精;而各因素对萌发数影响的主次水平因种类的不同而有所不同：对白花油麻藤影响的主次水平为升汞>次氯酸钠>酒精，对大果油麻藤影响的主次水平为升汞>酒精>次氯酸钠，对常春油麻藤影响的主次水平为酒精>次氯酸钠>升汞。由此表明，除常春油麻藤的萌发数外，升汞对4种油麻藤的污染率以及3种油麻藤的萌发数均起主导作用。由表7的数据可得，4种油麻藤低污染率的最优组合分别是，美叶油麻藤为A3B2C3，白花油麻藤为A3B3C3，大果油麻藤和常春油麻藤的均为A2B3C2;4种油麻藤萌发数的最优组合分别是：美叶油麻藤和常春油麻藤均為A3B2C2，白花油麻藤、大果油麻藤均为A3B2C3。由此表明，美叶油麻藤灭菌的最优处理为酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞10～15 min。白花油麻藤灭菌的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10～15 min，再用升汞15 min。大果油麻藤低污染率的最优组合是酒精40 s后次氯酸钠15 min，再用升汞10 min，高萌发数的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞15 min。常春油麻藤低污染率的最优组合是酒精40 s后次氯酸钠15 min，再用升汞10 min，高萌发数的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞10 min。

3 讨论与结论

消毒是组培快繁的一个重要环节，成功与否直接决定着组培快繁的成功。消毒一方面要把表面微生物杀死，另一方面还要减少消毒剂对其组织和表面细胞的伤害，这样才能获得不污染且存活率较高的外植体。单一使用一种消毒剂污染率极高，例如试验中4种油麻藤种子单独采用75%酒精消毒的污染率均较高。因此，油麻藤种子消毒以几种消毒剂组合为宜。本试验对4种油麻藤采用了酒精、次氯酸钠和升汞3种消毒剂进行不同浸泡时间的消毒试验。结果表明：酒精和次氯酸钠对4种油麻藤的污染率、萌发数的影响不大;而升汞对4种油麻藤的污染率的影响较大，对种子萌发数的影响，除对常春油麻藤的影响不大外，对其余3种的萌发数均有显著影响。4种油麻藤的萌发数最优组合有所差异，产生这种差异的原因一方面可能是由物种自身特性决定的，也可能与消毒剂类型有关。酒精、次氯酸钠、升汞的消毒原理有所不同：75%酒精通过在细菌表面蛋白未变性前向菌体内部渗入从而使细菌蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细菌;次氯酸钠通过水解形成次氯酸后又分解成新生态氧，新生态氧将菌体和病毒上的蛋白质氧化后变性从而杀死病原微生物;Hg2+通过与细菌细胞中的酶或蛋白质上的-SH 基结合而使之失活或变性从而杀死细菌，但升汞对真菌的芽孢消毒无效[18]。由于每种消毒剂的消毒原理有所差异，因此，消毒对物种的影响也不同，消毒效果以及最优组合也不同。

在本研究中，油麻藤种子萌发率极低，原因可能有两个。一是与种子的成熟度有关，另一个与种皮坚硬有关。油麻藤分布在热带、亚热带地区，在6月会出现营养和生殖共同生长的现象[19-21]，植物各部位为了争夺营养会提升自身部位的竞争力，芽和果實都具有很高的生活力，但此时的种子成熟度较低，胚未完全发育形成，不利于萌发。10月后果实已完全成熟，因为缺少竞争，种子生活力低于6月的，因此萌发率低，有的甚至长时间不发芽[13]。据研究报道，常春油麻藤种子不经任何处理的发芽率为28.3%，但若将种皮磨破后，发芽率明显高于种皮完好的种子发芽率，可达71.7%[11]。还有研究表明，萌发前，通过磨破种皮，可有效提高油麻藤种子的萌发效果[22]。因此，提高油麻藤种子的萌发率，应选择成熟度60%的种子进行消毒，经过破壳处理后再接种。

本研究结果表明，3种不同消毒剂对种子的灭菌效果影响有所不同。酒精和次氯酸钠对4种不同油麻藤属植物的污染率、萌发数无显著影响;升汞对污染率的影响显著，对萌发数的影响，除了常春油麻藤无显著影响，其余3种均有显著影响。各种油麻藤的消毒灭菌最优组合均不同：美叶油麻藤灭菌的最优处理为酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞10～15 min;白花油麻藤灭菌的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10～15 min，再用升汞15 min;大果油麻藤低污染率的最优组合是酒精40 s后次氯酸钠15 min，再用升汞10 min，高萌发数的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞15 min;常春油麻藤低污染率的最优组合是酒精40 s后次氯酸钠15 min，再用升汞10 min，高萌发数的最优组合是酒精60 s后次氯酸钠10 min，再用升汞10 min。

参考文献：

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第41卷.[M].北京：科学出版社，1995.

[2]谢月英，陈锡林.浙江宁油麻藤药用植物引种试验初报[J].中草药，1999（9）：692-694.

[3]周荣汉，杨星昊，唐正平.中国油麻藤属左旋多巴资源植物的研究[J].中药材，1988（3）：22-24.

[4]巩江，倪士峰，路锋，等.油麻藤属药用研究概况[J].安徽农业科学，2010，38（22）：12184-12185.

[5]张蓝月，叶向斌，刘念，等.白花油麻藤的地理分布及适生区预测[J].广西植物，2012，32（1）：27-32.

[6]曾宋君.紫色禾雀花的栽培繁殖[J].花卉，2009（9）：16.

[7]林茂，李进华，孙开道，等.禾雀花的繁育及栽培管理技术[J].中国热带农业，2018（5）：84-86.

[8]吴桂萍，宁祖林，李冬梅， 等.油麻藤属植物资源及其开发利用价值[J].中国园艺文摘，2016，32（4）：72-74，116.

[9]高靖.常春油麻藤的开发优势和应用研究[J].绿色科技，2012（6）：115-116.

[10]陈永霞，罗强.常春油麻藤自然繁殖特性及人工繁殖技术研究[J].南方农业，2015，9（28）：30-31.

[11]田丽华，宁祖林，李冬梅， 等.常春油麻藤种子萌发和扦插繁殖试验[J].安徽农业科学，2016，44（22）：149-151.

[12]许怡晓，何才生，刘海石， 等.常春油麻藤扦插试验[J].绿色科技，2018（13）：51-52.

[13]游云飞.常春油麻藤离体再生体系建立试验[J].福建林业科技，2018，45（3）：57-63.

[14]汪腾越，周再知，裘珍飞，等.土沉香组织培养外植体消毒方法的研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32（3）：44-48.

[15]周小华，张伟，黄志萍，等.大花序桉外植体消毒及诱导试验[J].福建林业科技，2018，45（4）：47-51.

[16]刘昊，杨雨晴，邵一飞，等.番茄种子消毒方法探究[J].山东农业大学学报（自然科学版）， 2019（3）：1-5.

[17]郑祥亁，陈凌娜，崔永忠，等.云南甜龙竹和黄竹种子灭菌条件和萌发特性初步研究[J].林业科学研究，2018，31（6）：76-82.

[18]陈丽闽，毛碧增.影响无菌苗体系建立因素的研究进展[J].浙江农业科学，2011 （3）： 483-487.

[19]吴桂萍，宁祖林，李冬梅，等.油麻藤属植物资源及其开发利用价值[J].中国园艺文摘，2016（4）：72-74，116.

[20]芦夕芹，彭志金.常春油麻藤的开发利用[J].中国林副特产，2007（2）：85-86.

[21]何铮昳，黎明.常春油麻藤的物候节律研究[J].西部林业科学，2005（3）：50-52，62.

[22]谢月英，陈锡林.浙江宁油麻藤药用植物引种试验初报[J].中草药，1999，30（9）：692-694.

（责任编辑：柯文辉）