阿美替尼联合安罗替尼通过下调PI3K/AKT通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖

摘要：目的 探究阿美替尼联合安罗替尼抑制非小细胞肺癌的作用。方法 CCK-8 法、集落克隆法和流式细胞术检测不同浓度阿美替尼和安罗替尼对PC-9细胞和HCC827细胞增殖、细胞存活和细胞凋亡的影响；SynergyFinder模型评价阿美替尼与安罗替尼的协同作用；Transwell 小室实验检测阿美替尼联合安罗替尼对PC-9 细胞和HCC827 细胞侵袭及迁移的作用；Westernblotting 实验检测阿美替尼联合安罗替尼对PC-9 细胞和HCC827 细胞凋亡和侵袭迁移相关蛋白Bax、Bcl-2、E-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9及PI3K-Akt通路关键蛋白表达的影响。结果 阿美替尼作用于PC-9细胞的IC50为1.701 μmol/L，安罗替尼作用于PC-9细胞的IC50=4.979 μmol/L，协同得分（ZIP）为19.112；阿美替尼对HCC827细胞IC50=2.961 μmol/L，安罗替尼对HCC827细胞IC50=7.934 μmol/L，协同得分（ZIP）为12.325，阿美替尼联合安罗替尼能够显著抑制PC-9细胞和HCC827细胞增殖（Plt;0.05）。相比于单药组，集落克隆结果表明阿美替尼联合安罗替尼能够显著抑制PC-9细胞和HCC827细胞存活（Plt;0.01）；流式细胞术结果表明，阿美替尼联合安罗替尼能够促进PC-9细胞和HCC827细胞发生凋亡（Plt;0.05）；Transwell实验结果表明，阿美替尼联合安罗替尼能够显著抑制PC-9细胞和HCC827细胞的侵袭迁移能力（Plt;0.01）；Western blotting实验结果表明，阿美替尼联合安罗替尼能够显著促进PC-9 细胞和HCC827 细胞中E-Cadherin 和Bax 蛋白的表达，抑制Bcl-2、Vimentin、MMP2 和MMP9蛋白的表达（Plt;0.01），同时显著降低了PI3K-Akt通路中关键蛋白PI3K、Akt的磷酸化蛋白水平（Plt;0.01）。结论 阿美替尼联合安罗替尼通过下调PI3K-Akt通路抑制NSCLC肿瘤细胞，这种联合治疗方式可能成为临床上治疗 NSCLC患者的一种潜在治疗策略。

关键词：非小细胞肺癌；阿美替尼；安罗替尼；凋亡；侵袭迁移；PI3K-Akt

最新癌症统计报告显示，肺癌新增病例和死亡人数均位于世界第一，严重威胁人类健康［1］。临床上非小细胞肺癌（NSCLC）发病率通常占肺癌的80%～85%［2， 3］。虽然临床上积极采用各种方法用于非小细胞肺癌治疗，但其治疗依然是临床瓶颈问题［4-6］。因此，积极探索防治非小细胞肺癌的策略势在必行。

阿美替尼（Aum）是一种不可逆的第3 代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗表皮生长因子受体（EGFR）突变型NSCLC［7］。安罗替尼（An）是一种口服小分子多受体酪氨酸激酶抑制剂，对肿瘤血管生成和生长具有广谱抑制作用，An已被批准用于治疗局部晚期或转移性NSCLC患者［8-10］。Aum和An联合使用治疗伴有EGFR突变的胶质母细胞瘤患者，患者受益于Aum联合An和替莫唑胺［11］。一项Ⅱ期临床研究在未经治疗的EGFR突变和晚期NSCLC患者中，进行了一项非随机II期试验（ChiCTR2000035140），口服多靶点抗血管生成TKI 与第3 代EGFR-TKI（osimertinib 或aumolertinib）。结果表明：在未经治疗的EGFR突变型晚期NSCLC患者中，联合应用An和第3代EGFR- TKIs的毒性显著增加，表明联合治疗策略在这种情况下是不恰当的治疗选择［12］。而在陈华林教授团队Aum联合An一线治疗EGFR突变型NSCLC患者的II期临床研究ALWAYS的最新数据中，3代EGFR-TKI联合抗血管生成药物的联合方案使患者客观缓解率（ORR）达到96.15%，疾病控制率（DCR）则为100%［13］。但目前尚无相关基础研究，基于此，我们进行相关基础研究，观察Aum联合An 对NSCLC细胞是否具有更好的抑制作用并探索其作用机制。

磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的失调与肺癌的肿瘤发生、转移、凋亡和耐药密切相关［14-16］。PI3K/Akt信号通路的激活与NSCLC恶性进展密切相关，可能是抑制非小细胞肺癌的重要靶点［17， 18］。有研究表明，PI3K抑制剂改善An耐药，且PI3K抑制剂与An联合治疗通过降低PI3K/Akt/mTOR抑制An 耐药骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和细胞骨架形成，并诱导凋亡［19-22］。Aum联合An对PI3K/Akt通路的作用还有待研究。

本研究以PC-9 和HCC827 细胞作为研究对象，旨在探索Aum联合An 对NSCLC细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移以及PI3K-Akt通路的作用，使用SynergyFinder模型进行两药协同评分，为临床寻找合适的联用剂量提供了基础研究数据，证明了Aum联合An通过下调PI3KAkt通路抑制NSCLC细胞，为Aum联合An用于临床治疗NSCLC提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

细胞株：非小细胞肺癌PC-9 细胞和HCC827 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。试剂：Aum（江苏豪森药业有限公司，）、An（正大天晴药业有限公司）、1640培养基（Gibco）、胎牛血清（ExCellBio）、CCK-8试剂（APEBIO）、胰酶消化液（Biosharp）、青霉素－链霉素溶液（Biosharp）、RIPA裂解液（碧云天）、AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒（贝博生物）、Transwell小室（Corning公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Biosharp）。抗体信息（表1）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC-9细胞和HCC827细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素－链霉素的1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞存活率 消化处理PC-9、HCC827细胞，牛鲍计数板计数，使细胞悬液浓度为5×104 /mL，充分混悬后接种于96 孔板中，每孔加100 μL细胞悬液，放于37 ℃、5% CO2培养箱培养。待细胞密度达到60%～80%时，吸除培养液，加入含有不同浓度Aum和An（0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的培养基，每组设置6个复孔，孵育24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液（避光），37 ℃培养箱中孵育30 min，酶标仪在450 nm 处测定吸光度（A）值；PC-9 细胞联合给药浓度为Aum：0、0.25、0.5、1、2 μmol/L；An：0、0.5、1、2、4 μmol/L，HCC827细胞联合给药浓度为Aum：0、0.25、0.5、1、2 μmol/L；An：0、1、2、4、8 μmol/L。配置含药培养基时，使用含不同浓度Aum（0、0.25、0.5、1、2 μmol/L）的培养基作为母液，使用倍比稀释法配置含不同浓度An（0、0.5、1、2、4 μmol/L）的培养基对PC-9细胞给药，24 h后，每孔加入10 μLCCK-8 溶液，培养箱中孵育30 min左右，测定吸光度A值。HCC827同PC-9细胞操作。细胞存活率=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 将PC-9 和HCC827细胞接种于6 孔板中，2×105/孔，完全培养液培养，待细胞密度达到60%～80%时，吸去孔内培养液，PC-9细胞每孔分别加入空白培养液、含Aum（ 1 μmol/L）的培养液、含An（4 μmol/L）的培养液、含Aum（1 μmol/L）和An（4 μmol/L）的培养液各2 mL，HCC827 细胞每孔分别加入空白培养液、含Aum（3 μmol/L）的培养液、含An（8 μmol/L）的培养液、含Aum（3 μmol/L）和An（8 μmol/L）的培养液各2 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。收集细胞于10 mLEP管中，1500 r/min离心10 min，弃上清，每管加入200 μL AnnexinⅤ结合液重悬细胞，每管3 μL Annexin Ⅴ-FITC，冰上孵育15 min，每管加入5 μL PI染色液，避光混匀、冰上孵育10 min。每管再加入200 μL Annexin-Ⅴ结合液，混匀后用纱布过滤，加入流式管中，样品在1 h 内用流式细胞仪检测。

1.2.4 Transwell侵袭及迁移实验 基质胶与无血清培养液按照1∶8 比例稀释，在Transwell 小室上室内加入60 μL基质胶，置于37 ℃恒温培养箱中40 min，待基质胶凝固。消化处理PC-9细胞，分别使用无血清1640培养液调整为含Aum（1 μmol/L）、含An（4 μmol/L）、含Aum（1 μmol/L）和An（4 μmol/L）的2×105 /mL 细胞悬液；消化处理HCC827细胞，分别使用无血清1640培养液调整为含Aum（3 μmol/L）、含An（8 μmol/L）、含Aum（3 μmol/L）和An（8 μmol/L）的2×105/mL细胞悬液。取100 μL细胞悬液加入上室，下室加入700 μL含10%胎牛血清的培养液，每组设置2个复孔，实验重复3次；培养24 h 后取出小室，用PBS轻轻冲洗，用4%多聚甲醛室温固定15 min，用结晶紫染液室温染色20 min。光学倒置显微镜下计数侵袭至微孔膜下层的细胞，每个样本选取3 个视野，取平均值。迁移实验无铺基质胶步骤，其余步骤同侵袭实验。

1.2.5 集落克隆实验 通过集落形成实验探究Aum联合放射治疗对细胞存活的影响。将PC-9 和HCC827细胞以2×103 /孔种于6 孔板中，将细胞置于37 ℃、含5%CO2 的培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，用Aum（0.1 μmol/L）和An（0.4 μmol/L）分别单药处理或联合处理PC-9细胞，Aum（0.3 μmol/L）和An（0.8 μmol/L）分别单药处理或联合处理HCC827 细胞。细胞在6 孔板中培养约10 d，约每3 d更换1次细胞培养基。10 d后，吸除培养基，多聚甲醛固定形成的集落，然后用0.5%结晶紫对集落进行染色，风干后计数细胞集落的数量，采用Image J软件分析计算集落数量。

1.2.6 Western blotting 实验检测蛋白表达 将PC-9 和HCC827细胞接种于100 mm大皿中，当细胞密度达到60%～80%时，PC-9 细胞中分别加入1640 培养液、含Aum（1 μmol/L）、含An（4 μmol/L）、含Aum（1 μmol/L）和An（4 μmol/L）的培养液处理，HCC827细胞中分别加入1640 培养液、含Aum（3 μmol/L）、含An（8 μmol/L）、含Aum（3 μmol/L）和An（8 μmol/L）的培养液处理。给药24 h后刮取蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。根据公式计算加入上样缓冲液和裂解液量，充分混匀，使终浓度相同，蛋白在95 ℃条件下加热5 min。20 μg蛋白上样电泳（上层胶电泳70 V 30 min，下层胶电泳120 V90 min），半干转法转至PVDF膜上（恒压24 V 30 min），快速封闭液封闭20 min。根据目标蛋白分子量剪切PVDF膜，孵育相应一抗，4 ℃孵育过夜。次日用TPBS室温清洗3次，放入对应二抗中，室温孵育1.5 h，曝光机显影曝光，采用Image J软件分析条带灰度值。

1.2.7 协同得分的测定 通过 CCK-8 实验探究Aum联合An对细胞增殖的影响并计算细胞存活率，步骤同上述CCK-8实验方法。选用Aum或An单独给药PC-9和HCC827 细胞时，细胞存活率为80%的浓度为起始浓度，包括IC50值在内，共设置5个联合给药浓度点。其中，PC-9细胞联合给药浓度为Aum：0、0.25、0.5、1、2 μmol/L；An：0、0.5、1、2、4 μmol/L。HCC827 细胞联合给药浓度为Aum：0、0.25、0.5、1、2 μmol/L；An：0、1、2、4、8 μmol/L。配置含药培养基时，使用含不同浓度Aum（0、0.25、0.5、1、2 μmol/L）的培养基作为母液，使用倍比稀释法配置含不同浓度An（0、0.5、1、2、4 μmol/L）的培养基对PC-9细胞给药。细胞存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。同理，使用Aum联合An 对HCC827 细胞给药。CCK-8 实验检测给药24 h后两种细胞的存活率。使用SynergyFinder程序进行分析，将Aum和An联合用药处理PC-9和HCC827细胞的细胞存活率以矩阵格式输入SynergyFinder进行分析，ZIP synergy score 若大于10，两种药物之间的相互作用是协同的；ZIP synergy score 小于-10，两种药物之间的相互作用是拮抗的；ZIP synergy score 从 -10 到10：两种药物之间的相互作用是相加的。

1.2.8 统计学方法 使用GraphpadPrism8.0对数据进行统计学分析并作图，计量资料以均数±标准差示，组间均数比较采用LSD-t检验，以Plt;0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Aum和An抑制NSCLC细胞增殖与存活

CCK-8 实验测得Aum作用于PC-9 细胞的IC50为1.701 μmol/L（图1A），An 作用于PC-9 细胞的IC50 为4.979 μmol/L（图1B）；Aum 对HCC827 细胞IC50 为2.961 μmol/L（图1C），An 对HCC827 细胞IC50 为7.934 μmol/L（图1D）。

集落克隆结果显示：与空白组相比，Aum组、An组以及两药联合组抑制PC-9 及HCC827 的细胞活力，其中Aum联合An组作用优于单独使用Aum或An组，且差异具有统计学意义（Plt;0.01，图1E～G）。

2.2 Aum联合An 对PC-9 及HCC827 细胞的抑制具有协同作用

CCK-8实验检测给药24 h后PC-9和HCC827细胞活力，相较于单独处理组，Aum联合An能够进一步抑制细胞增殖和存活（图2A、B）。得到两药联合处理PC-9细胞的ZIP synergy score为19.112（图2C、D），两药联合处理HCC827细胞的ZIP synergy score为12.325（图2E、F）。

2.3 Aum联合An诱导PC-9细胞及HCC827细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡情况，与对照组相比，Aum和An处理PC-9和HCC827细胞凋亡率明显增加，差异具有显著性（Plt;0.05，图3A～C），与单药组相比，联合组中PC-9细胞的凋亡率具有显著性（Plt;0.01，图3A、B），HCC827细胞的凋亡率也具有显著性（Plt;0.05，图3A、C）；Western blotting实验检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，结果表明，与对照组相比，不同浓度Aum或An处理组PC-9 和HCC827 细胞中Bax 蛋白表达显著升高（Plt;0.01，图3E），Bcl-2 蛋白表达显著降低（Plt;0.05，图3E），与单用Aum组相比，两药联合时两种蛋白表达也具有显著性（Plt;0.01，图3D～F）。

2.4 Aum联合An 抑制PC-9 细胞及HCC827 细胞的侵袭及迁移

与对照组和单药组相比，Aum和An联合处理组中PC-9 和HCC827 细胞的侵袭迁移数目明显减少，且细胞迁移速度明显减慢（Plt;0.05，图4）。Western blotting实验检测侵袭迁移相关蛋白E-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的表达，结果表明，与对照组相比，Aum和An单药及联合处理组中，PC-9和HCC827 细胞的ECadherin蛋白表达显著升高（Plt;0.01），Vimentin、MMP2蛋白表达显著下降（Plt;0.01，图5）。

与单药组相比，Aum联合An时MMP9蛋白表达显著下降（Plt;0.01，图5C）。

2.5 Aum联合An下调NSCLC中PI3K-Akt通路蛋白

Western blottimg 结果显示，与对照组相比，Aum和An 单药及联合处理组中，PC-9 和HCC827 细胞的P-PI3K、P-Akt 蛋白表达。显著下降 （Plt;0.01，图6）。与单药组相比，Aum联合An 显著降低了PI3K-Akt 通路中关键蛋白PI3K、Akt 的磷酸化蛋白水平（Plt;0.01，图6）。

3 讨论

Aum是第3代EGFR-TKI，通过在EGFR酪氨酸激酶结构域的ATP结合位点与Cys797不可逆地结合抑制EGFR激活，抑制肿瘤细胞的生长，加速细胞凋亡［23］。An是一种小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，其通过靶向血管内皮生长因子受体（VEFGR）、血小板衍生生长因子受体（PDGF）、干细胞因子受体（c-Kit）以及成纤维细胞生长因子受体（FGFR）等［24-26］，对肿瘤血管生成和NSCLC细胞生长具有广泛的抑制作用［27］。临床上被批准为晚期肺癌患者三线治疗药物［28， 29］。研究发现，An可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR等通路，抑制NSCLC细胞的生长及侵袭迁移［30］，从而抑制NSCLC的恶性发展［31］，已有研究发现An可以通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制套细胞淋巴瘤增殖和诱导凋亡［ 32］。目前Aum联合An的研究较少，缺乏相关基础研究［11］，本实验研究了Aum联合An对NSCLC细胞的的作用，发现Aum联合An相比于单药显著抑制PC-9和HCC827细胞增殖同时促进凋亡。

虽然有II 期临床试验对An 联合三代EGFR-TKI（osimertinib 或aumolertinib）对晚期NSCLC的治疗策略进行研究，表明在未经治疗的EGFR 突变型晚期NSCLC患者中，联合应用An和第3代EGFR-TKIs是不恰当的治疗选择［12］，但其样本量较少（仅11 例），使用Aum 联合An 的患者仅2 例（1 例19DEL 突变，1 例L858R突变），其中L858R突变患者在经历两个月联合治疗后病情趋于稳定，19DEL突变患者虽因为肺栓塞第1次成像评估之前停止试验，因而联合用药临床疗效有待扩大样本量进行验证［12］。相反，近期陈华林教授团队最新的临床研究报告了II期临床研究ALWAYS的初步数据，总计纳入26例晚期EGFR突变型NSCLC患者的完整数据，显示Aum联合An一线治疗晚期EGFR突变型NSCLC患者取得了较好的疗效［13］；有正在进行的临床研究表明An联合EGFR-TKIs有较好的效果：ORR达95.45%，DCR 达100%。中位缓解深度（DpR）为42.0%，且安全性可控［33， 34］。一项临床回顾性分析也评价了阿美替尼联合安罗替尼对于治疗肺癌脑转移患者有更好的疗效［35］。以上数据表明Aum联合An在EGFR突变的脑转移NSCLC患者的一线治疗中显示出初步疗效。有相关临床研究表明已有EGFR p.L858R突变胶质瘤患者受益于Aum联合An和替莫唑胺［11］，Aum联合An是一种具有潜力的联合用药策略。我们通过一系列基础实验研究，发现Aum联合An 的效果优于单药，并且通过不同剂量的设置，使用SynergyFinder模型进行两药协同评分，为临床寻找合适的联用剂量提供了基础研究数据。

肿瘤细胞侵袭迁移是肿瘤恶化的主要驱动因素，是影响NSCLC患者预后及导致患者死亡的主要原因［36］。上皮间质转化（EMT）是一个关键的细胞程序，使极化上皮细胞向间充质表型过渡，增加细胞运动性［37， 38］。为了获得癌症转移进展的侵袭性表型，癌细胞利用EMT促进其与原发肿瘤分离并传播到血液循环中［39， 40］。EMT在肿瘤细胞侵袭转移中起着关键作用，其分子生物学特征在于上皮细胞标志物（如E-cadherin 表达下调）和间质细胞标志物（如Vimentin、MMP2 及MMP9 表达上调）表达的变化［41-43］。基质金属蛋白（MMPs）是与肿瘤发生相关的最重要的蛋白酶家族，细胞外基质和基底是癌细胞转移过程中的一道屏障，其降解是肿瘤侵袭迁移的重要环节 ［44］ 。MMPs是锌依赖性内肽酶，降解细胞外基质（ECM）中的蛋白质，作为多种疾病的潜在治疗靶点，MMPs 引起了科学家们的极大关注［1， 2］。例如，MMP2和MMP9在促进癌症转移和侵袭方面具有重要作用［47］。MMP2、MMP9能够降解IV型胶原蛋白，促进肿瘤细胞转移［44］。Transwell 实验和划痕实验结果表明相比于单药组，Aum 联合An 能够显著抑制PC-9 和HCC827细胞的侵袭和迁移能力，Western blotting实验结果表明相比于单药组，Aum联合An处理后，PC-9和HCC827 细胞中E-cadherin 蛋白表达显著上调，Vimentin 、MMP2和MMP9蛋白表达显著下调，。以上结果表明Aum联合An可能通过逆转上皮间质转化，抑制PC-9细胞和HCC827细胞侵袭和迁移。

PI3K/Akt/mTOR信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖，同时参与血管形成，在肿瘤的形成中扮演重要角色［40， 48， 49］。有研究表明，在非小细胞肺癌中，PI3K/Akt 通路在肿瘤发生和疾病进展中都有重要作用［17， 50， 51］；PI3K/Akt信号失活有助于非小细胞肺癌的细胞凋亡［52， 53］，PI3K/Akt信号通路可以调控NSCLC细胞的增殖［21］、侵袭迁移［7， 54-56］。研究发现，EGFR可以激活PI3K/Akt/mTOR途径介导细胞存活［57， 58］。Aum通过抑制EGFR激活从而抑制NSCLC细胞的生长［59］，An可以通过负调控PI3K/Akt信号通路抑制多种肿瘤细胞的生长和转移［60-62］。为进一步探究Aum 联合An 抑制NSCLC的作用机制，本研究通过Western blot实验检测PI3K-Akt通路关键蛋白表达，结果表明相比于单药组，Aum 联合An 处理后，PC-9 和HCC827 细胞中PI3K、AKT磷酸化蛋白表达显著降低。以上结果表明Aum联合An能够阻断NSCLC细胞PI3K/Akt通路关键蛋白的磷酸化。

综上所述，本研究发现Aum联合An具有较好的抗NSCLC的作用，两者联合可能通过抑制PI3K-Akt通路协同抑制NSCLC 增殖、侵袭、迁移，诱导细胞凋亡。Aum联合An 有望提高NSCLC临床治疗效果，为临床联合用药提供理论依据。

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（编辑：余诗诗）