安罗替尼联合放射治疗对食管鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及放射治疗敏感性的影响

董起杭，万里新，张 凯,王 卓,陶海云,杜云辉,高社干,兰子君,原 翔

(1.新乡医学院,河南 新乡 453003;2.南阳市中心医院肿瘤内科，河南 南阳 473000；3.南阳市中心医院放射治疗科，河南 南阳 473000；4.南阳市中心医院药学科，河南 南阳 473000；5.河南科技大学第一附属医院肿瘤内科，河南 洛阳 471003；6.河南省肿瘤表观遗传学重点实验室，河南 洛阳 471003)

食管癌发病率的地区差异较大，我国食管癌发病率和病死率分别居世界第6位和第4位[1-3]，且食管鳞状细胞癌约占我国食管癌的88%[4]。放射治疗作为食管癌的重要治疗手段之一，常与手术、化学治疗等治疗手段联合应用于临床治疗中。盐酸安罗替尼是我国自主研发的一种新型口服酪氨酸激酶抑制剂，能够选择性抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血小板衍生生长因子受体、纤维母细胞生长因子受体、干细胞因子受体c-Kit等激酶的活性，进而抑制肿瘤血管生长，发挥抗肿瘤效应[5-7]。盐酸安罗替尼针对肺癌、肾癌、软组织肉瘤等的多种临床试验已经取得了积极的结果[8-11]。但目前关于安罗替尼联合放射治疗对食管鳞状细胞癌细胞的作用的研究较少。本研究旨在探讨安罗替尼联合放射治疗对食管鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡及放射治疗敏感性的影响，以期为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞由河南省肿瘤表观遗传学重点实验室赠予并保存。

1.2 主要试剂与仪器盐酸安罗替尼原料药(国药准字H20180002，纯度：99.3%)购自连云港润众制药有限公司，细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自日本东仁化学科技(上海)有限公司，RPMI 1640培养基购自上海Hyclone公司，胎牛血清、青链霉素双抗购自美国Gibco公司，结晶紫染液购自福州Phygene公司，Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡检测试剂盒购自上海Thermo Fisher Scientific公司；倒置显微镜购自日本Nikon 公司，全自动酶标仪、细胞培养箱购自上海Thermo Fisher Scientific公司，全自动化学发光成像系统Tanon 5200购自上海天能科技有限公司。

1.3 细胞培养及分组将KYSE-150细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中常规传代培养。

收集对数生长期的KYSE-150细胞，胰蛋白酶消化后，用培养基重悬，以每孔3 000个细胞接种于96孔板中培养12 h，并随机分为 0 μmol·L-1安罗替尼组、2 μmol·L-1安罗替尼组、4 μmol·L-1安罗替尼组、8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组、128 μmol·L-1安罗替尼组，每组设3个复孔，分别用100 μL含终浓度为0、2、4、8、16、32、64、128 μmol·L-1安罗替尼的培养基进行培养。

另收集对数生长期KYSE-150细胞，胰蛋白酶消化后，用培养基重悬，接种于培养瓶中，并随机分为0 Gy单独照射组、2 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组、2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组，每组设置3个复瓶。0 Gy单独照射组、2 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组分别用不含安罗替尼的培养液培养48 h后，再次更换不含安罗替尼的培养液，并分别给予0、2、4、6 Gy的X射线照射；0 Gy联合照射组、2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组使用含终浓度4 μmol·L-1安罗替尼的培养液培养48 h后，更换为不含安罗替尼的培养液，同时分别给予0、2、4、6 Gy的X射线照射。

1.4 CCK-8法检测不同浓度安罗替尼组KYSE-150细胞的增殖能力0 μmol·L-1安罗替尼组(对照孔)、2 μmol·L-1安罗替尼组、4 μmol·L-1安罗替尼组、8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组、128 μmol·L-1安罗替尼组细胞使用不同浓度安罗替尼干预24、48、72 h时，弃原培养基，每孔加入110 μL 含体积分数10% CCK-8试剂的完全培养基，继续于培养箱中培养1 h，使用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)]/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。实验重复3 次，取均值。应用Graphpad Prism 8软件绘制细胞抑制曲线并计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，选择IC50值最小时的安罗替尼浓度及处理时间作为后续实验的药物处理条件。

1.5 平板克隆形成实验检测不同X射线吸收剂量的单独照射组和联合照射组细胞的克隆形成能力收集0 Gy单独照射组(单独对照组)、2 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组(联合对照组)、2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞，胰蛋白酶消化、重悬，以每孔500个细胞接种于 6 孔板中，于培养箱中培养至形成肉眼可见的细胞集落后，使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞表面，甲醛固定，结晶紫染色30 min，存活细胞被染成紫色，使用全自动化学发光成像系统拍照，并计数紫色细胞克隆数。应用Image J软件计数细胞集落，根据克隆个数计算各组细胞存活率，细胞存活率=实验组紫色细胞克隆数/对照组紫色细胞克隆数×100%，存活率越高表示放射线对细胞的杀伤能力越低。

1.6 单击多靶模型检测安罗替尼联合放射治疗对KYSE-150细胞放射治疗的敏感性将0 Gy单独照射组、2 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组归为单独照射组，将0 Gy联合照射组、2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞归为联合照射组。应用Sigma Plot 10.0软件，以单击多靶模型[12]拟合单独照射组和联合照射组的细胞存活曲线,存活分数(survival fractions，SF)=1-(1-e-D/D0)，D为照射剂量，D0为存活曲线指数区下降63%的SF所需放射剂量。放射增敏比(sensitizer enhancement ratio，SER)=单独照射组D0值与联合照射组D0值的比值。SER>1说明联合照射组细胞对放射治疗敏感性高于单独照射组。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡情况取0 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组经过相应干预后换液继续培养24 h的细胞，胰蛋白酶消化，2 000 r·m-1离心5 min，取沉淀物，PBS冲洗，计数后调整细胞密度为1×105L-1的细胞悬液，使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒处理细胞，按照试剂盒说明书进行操作，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，应用Flowjo软件计算细胞凋亡率。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 8组KYSE-150细胞增殖能力比较结果见表1。安罗替尼干预24 h时，2 μmol·L-1安罗替尼组、4 μmol·L-1安罗替尼组、8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组、128 μmol·L-1安罗替尼组细胞的增殖抑制率均显著高于0 μmol·L-1安罗替尼组(P<0.05)，且4 μmol·L-1安罗替尼组、8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组、128 μmol·L-1安罗替尼组细胞的增殖抑制率随安罗替尼干预浓度的升高而升高(P<0.05)。安罗替尼干预48、72 h时，0 μmol·L-1安罗替尼组、2 μmol·L-1安罗替尼组、4 μmol·L-1安罗替尼组、8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组、128 μmol·L-1安罗替尼组细胞的增殖抑制率随安罗替尼干预浓度的升高而升高(P<0.05)。0 μmol·L-1安罗替尼组细胞安罗替尼干预24、48、72 h时的增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。安罗替尼干预48 h时，4 μmol·L-1安罗替尼组、8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组细胞的增殖抑制率显著高于安罗替尼干预24 h后同药物处理浓度的安罗替尼组，差异有统计学意义(P<0.05)。安罗替尼干预72 h时，8 μmol·L-1安罗替尼组、16 μmol·L-1安罗替尼组、32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组、128 μmol·L-1安罗替尼组细胞的增殖抑制率显著高于安罗替尼干预24 h时同药物处理浓度的安罗替尼组，2 μmol·L-1安罗替尼组显著低于安罗替尼干预24 h，差异有统计学意义(P<0.05)。安罗替尼干预72 h时，32 μmol·L-1安罗替尼组、64 μmol·L-1安罗替尼组细胞的增殖抑制率显著高于安罗替尼干预48 h时同药物处理浓度的安罗替尼组，2 μmol·L-1安罗替尼组显著低于安罗替尼干预48 h时，差异有统计学意义(P<0.05)。安罗替尼处理食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞24、48、72 h时的IC50值分别为(12.7±0.5)、(3.7±1.0)、(6.8±0.7)μmol·L-1。

表1 8组KYSE-150细胞增殖能力比较

2.2 安罗替尼对细胞放射治疗敏感性的影响2 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组、2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞的存活率分别为(96.3±2.1)%、(85.7±1.9)%、(70.1±1.2)%、(84.2±0.7)%、(70.1±0.8)%、(41.4±1.6)%。2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞的存活率均显著低于相同照射剂量的单独照射组(t=9.468、13.107、24.855，P<0.05)。4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组细胞的存活率均显著低于2 Gy单独照射组，6 Gy单独照射组细胞的存活率显著低于4 Gy单独照射组，差异有统计学意义(t=6.483、18.762、12.024，P<0.05)。4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞的存活率均显著低于2 Gy联合照射组，6 Gy联合照射组细胞的存活率显著低于4 Gy联合照射组，差异有统计学意义(t=22.974、42.448、27.789，P<0.05)。单独照射组和联合照射组的D0值分别为5.84、4.11 Gy,SER为1.42。

2.3 安罗替尼联合放射治疗对KYSE-150细胞凋亡的影响结果见图1。0 Gy单独照射组、4 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组细胞的凋亡率分别为(2.5±0.2)%、(6.2±2.2)%、(7.4±2.3)%、(14.9±3.3)%。4 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组细胞凋亡率显著高于0 Gy单独照射组，差异有统计学意义(t=2.901、3.676、6.496,P<0.05)。4 Gy联合照射组细胞凋亡率显著高于4 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组，差异有统计学意义(t=3.799、3.230,P<0.05)。4 Gy单独照射组与 0 Gy联合照射组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=0.653，P>0.05)。

A:0 Gy单独照射组；B：4 Gy单独照射组；C：0 Gy联合照射组；D:4 Gy联合照射组。

3 讨论

放射治疗作为恶性肿瘤治疗的重要手段之一，在头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的治疗中发挥着极为重要的作用。近年来，随着精确放射治疗的发展，三维适形放射治疗、适形调强放射治疗等技术使肿瘤接受到足够的照射剂量的同时降低周围正常组织受量，从而提高放射治疗的疗效[13]。但在不改变传统体外放射治疗方式的前提下，周围正常组织耐受剂量仍是限制放射治疗剂量的重要因素，因此，需要寻找其他方式来提高放射治疗的疗效。VEGFR1参与肿瘤细胞血管的形成,其在肿瘤组织中的表达与患者的预后和放射治疗的疗效具有相关性，提示产生放射抵抗的部分原因是肿瘤组织表达的血管表皮生长因子水平较高[14-15]。安罗替尼作为VEGFR抑制剂可能通过抑制肿瘤血管生成而提高放射治疗对肿瘤患者的疗效。

SHI等[16]通过建立食管癌患者来源的移植瘤小鼠模型探讨安罗替尼联合放射治疗、化学治疗的临床效果，结果显示，放射治疗联合安罗替尼组小鼠的肿块生长抑制程度显著高于对照组(未接受治疗)、单独放射治疗组、放射治疗+顺铂组，且未观察到放射治疗联合安罗替尼组小鼠发生严重不良反应，这项实验为安罗替尼的临床应用提供了新思路，但仍需要大规模临床试验验证。本研究结果发现，安罗替尼呈剂量依赖性对食管鳞状细胞癌细胞发挥增殖抑制作用，说明安罗替尼可抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖能力。本研究结果显示，安罗替尼处理KYSE-150细胞24、48、72 h时的IC50值分别为(12.7±0.5)、(3.7±1.0)、(6.8±0.7)μmol·L-1，处理48 h时的IC50值最低，因此后续实验均以48 h为安罗替尼处理细胞时间，以安罗替尼处理KYSE-150细胞48 h的IC50值4 μmol·L-1为后续实验的药物处理剂量。

本研究结果显示，2 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞的存活率均显著低于相同照射剂量的单独照射组,4 Gy单独照射组、6 Gy单独照射组细胞的存活率均显著低于2 Gy单独照射组，4 Gy联合照射组、6 Gy联合照射组细胞的存活率均显著低于2 Gy联合照射组，6 Gy单独照射组细胞的存活率显著低于4 Gy单独照射组，6 Gy联合照射组细胞的存活率显著低于4 Gy联合照射组，说明安罗替尼联合放射治疗对食管癌细胞的杀伤能力高于单独放射治疗，且X射线照射量越高杀伤能力越强。此外，本研究结果显示，单独照射组和联合照射组的D0值分别为5.84、4.11 Gy,SER为 1.42，SER>1说明联合照射组细胞对放射治疗敏感性高于单独照射组，提示安罗替尼能增加食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞对放射治疗的敏感性。有研究表明，处于G2、M、G1细胞周期的肿瘤细胞对放射线照射比较敏感，而S期肿瘤细胞对放射线照射敏感性较低[17]。肿瘤细胞经过抑制VEGFR药物处理后，处于S期的细胞数量会明显减少[18]，安罗替尼可抑制VEGFR活性，这部分解释了安罗替尼增加食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞对放射治疗敏感性的机制。

张昊等[19]通过研究小细胞肺癌患者1 a生存率及血清中凋亡因子caspase-3、多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]表达水平来探讨放射治疗联合安罗替尼对小细胞肺癌患者预后的影响，结果显示，放射治疗联合安罗替尼较单独放疗患者血清中caspase-3水平明显提高，PARP水平明显降低，且1 a生存率更高，提示安罗替尼可通过与放射治疗协同促进小细胞肺癌细胞的凋亡。为探究安罗替尼对食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞增殖的抑制作用及增加放射治疗敏感性的机制，本研究使用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。研究表明，KYSE-150细胞放射治疗后的IC50值为4.3 Gy[20]，因此本研究选取其近似值4 Gy作为放疗照射剂量。本研究结果发现，4 Gy单独照射组、0 Gy联合照射组、4 Gy联合照射组的细胞凋亡率显著高于0 Gy单独照射组，4 Gy联合照射组细胞凋亡率显著高于4 Gy单独照射组、0 Gy单独照射组，说明安罗替尼联合放射治疗对KYSE-150细胞的凋亡作用高于单独放射治疗，且X射线照射量越高对细胞的促凋亡作用越强，提示安罗替尼联合放射治疗可能是通过促进细胞凋亡来抑制KYSE-150细胞的增殖及增加放射治疗敏感性。

综上所述，安罗替尼联合放射治疗可抑制食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞的增殖能力，并增加食管鳞状细胞癌细胞对放射治疗的敏感性，其机制可能是促进细胞凋亡。但本研究未能从细胞周期、细胞信号传导通路及动物实验等方面对放射治疗增敏机制做进一步的探究，仍需后续实验完善。