子痫前期患者胎盘组织中微RNA-210和Foxp3的表达及临床意义

张 澍，王春延，忽 平，姚 利

(南阳市中心医院/郑州大学附属南阳中心医院妇产科，河南 南阳 473000)

子痫前期(preeclampsia,PE)为妊娠期高血压疾病的一种类型，多在怀孕20周以后发生，临床多表现为血压升高、蛋白尿等，临床症状随着孕周增加而逐步加重。PE可进一步发展为重度PE甚至子痫，严重影响母婴健康，是孕产妇及围生儿死亡的主要原因[1]。PE的发病机制尚未完全明确，其发生与血管、遗传、免疫及环境等因素有关[2-3]。PE患者易出现炎症反应、免疫反应过度激活现象，其原因之一为母体调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)与辅助性T细胞(helper T cell,Th)比例失衡，从而对胎儿产生免疫排斥[4]。Treg细胞为炎症免疫抑制因子，可抑制自身免疫和免疫排斥反应，高水平的Treg细胞是成功妊娠的重要保障，Treg细胞减少可致母胎免疫耐受下降，促使PE发生，且与流产、早产等产科并发症密切相关[5]。Foxp3为叉头样转录因子家族成员之一，是Treg细胞特异性转录调节因子，可维持Treg细胞分化及功能。Th17细胞是以分泌白细胞介素(interleukin,IL)-17为特征的CD4+T细胞。Treg与Th17细胞比例失衡可致PE患者全身性炎症、免疫反应[6]。临床研究发现，微RNA-210(microRNA-210,miR-210)主要在妊娠期表达，可经外分泌进入母体循环，可调节滋养细胞侵袭、胎盘免疫活化及血小板聚集[7]。Foxp3为miR-210的靶基因，miR-210过表达时机体CD4+T细胞表达Foxp3下降，Treg细胞免疫抑制功能受到损伤。本研究旨在探讨PE患者胎盘组织中miR-210、Foxp3表达情况，分析PE的炎症、免疫激活的可能机制，以期为PE的病因及临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年6月至2019年12月南阳市中心医院妇产科收治且以剖宫产方式分娩的36例PE患者为PE组，选择同期正常妊娠孕妇35例为正常妊娠组，另选择体检健康的未妊娠女性40例为未妊娠组。PE组和正常妊娠组对象纳入标准：(1)PE患者符合PE诊断标准[8]；(2)均为单胎妊娠。排除标准：(1)合并高血压、糖尿病等基础疾病；(2)合并自身免疫性疾病或心血管疾病；(3)合并肝、肾等重要脏器疾病；(4)胎膜早破。PE组36例，年龄22～45(28.54±6.26)岁，体质量指数(body mass index,BMI)21.7～38.6(28.92±5.61)kg·m-2，分娩孕周37～40(37.86±1.36)周；初产妇23例，经产妇13例。正常妊娠组35例，年龄23～45(28.71±6.54)岁，BMI 20.5～36.3(26.53±5.30)kg·m-2，分娩孕周38～40(38.40±0.65)周；初产妇21例，经产妇14例。未妊娠组40例，年龄23～42(27.95±6.08)岁，BMI 16.8～25.9(21.43±1.85)kg·m-2。PE组与正常妊娠组、产次、分娩孕周比较差异均无统计学意义(P>0.05)，PE组、正常妊娠组和未婚妊娠组受试者年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，所有入组对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周静脉血Treg细胞和Th细胞水平的检测采集3组受试者晨起空腹外周静脉血6 mL(孕妇均于临产前采集血液)，肝素抗凝，4 h内应用流式细胞术检测外周静脉血CD4+CD25+CD127-Treg细胞、CD4+Th细胞水平，计算CD4+CD25+CD127-Treg细胞与CD4+Th细胞的比值(CD4+CD25+CD127-/CD4+)。

1.2.2 血清细胞炎症因子水平的检测采集3组受试者晨起空腹外周静脉血3 mL(孕妇均于临产前采集血液)，3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，采用酶联免疫吸附试验检测血清IL-6、IL-10、IL-17水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测PE组和正常妊娠组孕妇胎盘组织中Foxp3 mRNA、miR-210表达胎盘娩出后，生理盐水反复漂洗，剪取母面正中1 cm×1 cm×1 cm组织块数块，组织包括胎盘全层，但不包括羊膜层，采集时需要避开钙化区、出血点。将组织块置入冻存管中，每例4管，取好后立即置于液氮罐中，过夜后再置于-80 ℃冰箱保存。采用实时荧光定量PCR法检测胎盘组织中Foxp3 mRNA和miR-210表达。应用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA，使用反转录试剂盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA，操作按说明书严格执行。PCR反应体系20 μL：0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、2.0 μL cDNA、7.0 μL ddH2O、10.0 μL SYBR Green Mixture。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40个循环，重复3次。miR-210检测以U6为内参基因，Foxp3 mRNA检测以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因。miR-210上游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物序列为5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′；U6上游引物序列为：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，下游引物序列为5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；Foxp3上游引物序列为5′-CACTTCTGCTGTGGGTAGGT-3′，下游引物序列为5′-AAGGCAGCGGGACGATATGT-3′；GAPDH上游引物序列为5′-CCAAGAGTGATGGTGACGTC-3′，下游引物序列为5′-TCGTCGTTTGTCACCAACCTC-3′。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统(英国Syngene公司)进行图像分析，采用2-ΔΔCt法计算Foxp3 mRNA、miR-210的相对表达量。

1.2.4 Western blot法检测PE组和正常妊娠组孕妇胎盘组织中Foxp3蛋白表达取待测人胎盘组织，剪碎收集组织，加入总蛋白提取试剂，应用超声波细胞仪破碎组织细胞，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清，采用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度。取50 μg样品蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，使用 Tris 洗膜缓冲液洗涤2次，每次5 min；室温下封闭2 h；Tris洗膜缓冲液洗涤3次，每次10 min；滴加Foxp3单克隆抗体(滴度为11 000，英国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜；Tris 洗膜缓冲液洗涤3次，每次10 min；滴加二抗(12 000，英国Abcam公司)，室温下孵育2 h；Tris 洗膜缓冲液洗涤3次；每次 10 min；滴加超敏增强化学液进行显影，拍照，保存图片。应用GDS8000型凝胶成像分析系统(美国UVP公司)扫描蛋白质条带，以GAPDH为内参蛋白，测定目的条带的吸光度值。Foxp3蛋白相对表达量=目的蛋白条带吸光度值/内参蛋白条带吸光度值。

2 结果

2.1 3组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+水平比较PE组、正常妊娠组与未妊娠组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+分别为(6.72±0.31)%、(8.92±0.37)%、(8.85±0.34)%，3组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+水平比较差异有统计学意义(F=491.260，P<0.001)。PE组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+显著低于正常妊娠组和未妊娠组，差异有统计学意义(t=27.136、28.581，P<0.05)；正常妊娠组与未妊娠组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+比较差异无统计学意义(t=0.849，P>0.05)。

2.2 3组受试者血清IL-6、IL-10和IL-17水平比较结果见表1。3组受试者血清IL-6、IL-10、IL-17水平比较差异有统计学意义(F=53.584、133.925、42.392，P<0.05)。PE组受试者血清IL-6水平显著高于正常妊娠组，差异有统计学意义(t=9.170，P<0.05)；正常妊娠组受试者血清IL-6水平显著低于未妊娠组，差异有统计学意义(t=8.844，P<0.05)；PE组与未妊娠组受试者血清IL-6水平比较差异无统计学意义(t=1.608，P>0.05)。PE组受试者血清IL-10水平显著低于正常妊娠组和未妊娠组，差异有统计学意义(t=14.929、4.892，P<0.05)；正常妊娠组受试者血清IL-10水平显著高于未妊娠组，差异有统计学意义(t=10.914，P<0.05)。PE组受试者血清IL-17水平显著高于正常妊娠组和未妊娠组，差异有统计学意义(t=8.184、3.038，P<0.05)；正常妊娠组受试者血清IL-17水平显著低于未妊娠组，差异有统计学意义(t=7.325，P<0.05)。

表1 3组受试者血清IL-6、IL-10和IL-17水平比较

2.3 PE组和正常妊娠组受试者胎盘组织中Foxp3 mRNA和miR-210相对表达量比较结果见表2。PE组受试者胎盘组织中Foxp3 mRNA相对表达量显著低于正常妊娠组，miR-210相对表达量显著高于正常妊娠组，差异均有统计学意义(t=13.948、16.565，P<0.05)。

表2 PE组和正常妊娠组受试者胎盘组织中Foxp3 mRNA和miR-210相对表达量比较

2.4 PE组和正常妊娠组受试者胎盘组织中Foxp3蛋白相对表达量比较PE组和正常妊娠组受试者胎盘组织中Foxp3蛋白相对表达量分别为0.97±0.11、1.38±0.18，PE组受试者胎盘组织中Foxp3蛋白相对表达量显著低于正常妊娠组，差异有统计学意义(t=11.625，P<0.05)。

3 讨论

PE早期患者临床症状不明显，多表现为轻度血压升高、蛋白尿及水肿[9]；随着病情进展，患者可出现恶心、呕吐及明显的血压升高和蛋白尿等，甚者发生抽搐、昏迷，可危及生命[10]。

PE的诱因为母体免疫系统对滋养层父系来源的抗原异常反应。胚胎生长的重要因素之一为免疫耐受，母体对胚胎所产生的免疫耐受无法满足生长要求是PE发病机制之一[11]。CD4+CD25+Treg细胞具有抑制机体免疫功能的作用，在免疫耐受中承担着重要作用，可维持内环境稳定，抑制机体对异体物质的排斥[12-13]。Foxp3属于叉头转录因子家族，仅在CD4+CD25+Treg细胞中表达，同时，CD4+CD25+Treg细胞会受到Foxp3基因及其转录蛋白质的特异性作用[14]。正常状态下，妊娠早期CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞明显增多，到中期稍微下降，分娩后则明显减少；然而，PE患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞明显减少，且与PE病情严重程度密切相关[15]。本研究结果显示，PE组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+显著低于正常妊娠组和未妊娠组，正常妊娠组与未妊娠组受试者外周静脉血CD4+CD25+CD127-/CD4+比较差异无统计学意义；提示PE患者存在Treg细胞减少，母体对胎儿所产生的免疫耐受无法满足生长要求可能与此变化有关。

当机体无炎症损伤时，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可抑制效应T细胞形成，诱导Foxp3+Treg细胞产生，以维持自身耐受能力[16]；然而，当机体天然免疫系统被炎症反应、免疫反应激活后，其产生的IL-6可抑制TGF-β1诱导Treg细胞产生这一过程，同时可诱导促炎性T细胞(以Th17细胞为主)产生[17]。本研究结果显示，PE组受试者血清IL-6水平显著高于正常妊娠组，正常妊娠组受试者血清IL-6水平显著低于未妊娠组；PE组受试者血清IL-17水平显著高于正常妊娠组和未妊娠组，正常妊娠组受试者血清IL-17水平显著低于未妊娠组；PE组受试者血清IL-10水平显著低于正常妊娠组和未妊娠组，正常妊娠组受试者血清IL-10水平显著高于未妊娠组；说明孕妇血清炎症因子会因妊娠发生改变，相比于未妊娠者，孕妇血清IL-6、IL-17水平明显降低，IL-10水平明显升高；而当孕妇发生PE时，血清IL-6、IL-17水平明显升高，IL-10水平明显降低，提示炎症反应参与了PE的发生及进展。此外，本研究结果显示，PE组受试者胎盘组织中Foxp3 mRNA相对表达量显著低于正常妊娠组，miR-210相对表达量显著高于正常妊娠组，PE组受试者胎盘组织中Foxp3蛋白相对表达量显著低于正常妊娠组；说明PE患者胎盘组织中Treg细胞转录因子Foxp3 mRNA表达显著减低，提示Treg/Th17失衡，其可能导致母体对胎儿的免疫耐受遭到破坏。

综上所述，PE患者Treg细胞显著减少，Treg/Th17细胞失衡，引起母体对胎儿的免疫耐受遭到破坏；胎盘组织中Foxp3表达水平下降可能与miR-210表达升高有关，但仍需进一步研究证实。