聚乙烯亚胺修饰的铁酸镍-氧化石墨烯复合物在磷酸化多肽富集中的应用

摘要 制备了一种聚乙烯亚胺（PEI）修饰的铁酸镍-氧化石墨烯复合物材料GO@PEI-NiFe2O4，用于选择性净化和富集生物样品中的磷酸化肽段。此复合材料表面的Ni2+和Fe3+可与磷酸基团配位，从而选择性地吸附磷酸化肽段，修饰的PEI 增强了复合材料的亲水性，有利于其与磷酸化肽段结合。此外，复合材料中的NiFe2O4 具有磁性，可使其快速从溶液中分离出来。以β-酪蛋白（β-Casein）为样品，考察了复合材料对胰酶酶解液中的磷酸化肽段的富集性能，并与GO@NiFe2O4（未被PEI 修饰）富集的结果进行了比较，同时探讨了复合材料的吸附机理。采用磷酸化肽段pTyr测定了复合材料对pTyr 的静态和动态吸附曲线，最大吸附容量可达36.2 μg/mg。研究结果表明，此复合材料能够有效去除非磷酸化肽段等干扰组分的影响，高效地富集复杂基体中的磷酸化肽段。大鼠肝脏蛋白胰酶酶解液经过富集后，采用质谱可鉴定出1535 条磷酸化肽段，其富集效果显著优于Fe3+-IMAC 商品化试剂盒。本研究为磷酸化肽段的富集提供了一种高选择性材料，在磷酸化蛋白质组学研究中具有潜在的应用前景。

关键词 磷酸化肽段；铁酸镍；聚乙烯亚胺；氧化石墨烯；磁响应

生物体内许多重要的生理生化活动都与蛋白质磷酸化有关，如细胞的信号传导、分化和增殖等[1-3]。蛋白质磷酸化的异常还会导致很多疾病的发生和发展[4-8]，研究蛋白质磷酸化有助于揭示疾病发生发展机制，发现疾病的相关生物标志物，因此备受关注。质谱分析技术具有定性和定量分析能力强、分析速度快、通量高、分辨率和灵敏度高等优点，已成为蛋白质组学研究不可或缺的分析手段[9-11]。复杂生物样品中磷酸化蛋白质的鉴定由于其样品基体干扰大、待测组分丰度低等因素，无法用质谱直接检测[12-13]。磷酸化多肽在质谱分析前，样品通常需要先通过净化和富集，以去除干扰组分的影响[14]。因此，富集材料的性能对磷酸化蛋白质的鉴定具有关键作用，开发高效、特异性强的富集材料对磷酸化蛋白质的检测至关重要。

金属氧化物亲和色谱法（Metal oxide affinity chromatography， MOAC）对复杂基体中的磷酸化肽段具有较好的富集效果，其富集材料表面的金属阳离子可特异性识别磷酸化肽段的磷酸基团并形成复合物[15-16]。这些富集材料表面的金属阳离子通过化学键与氧原子结合，稳定性强，在富集过程中不易丢失，已有多种用于磷酸化肽段富集的MOAC 金属氧化物被报道[17-22]，如TiO2、CeO2 和MoO3 等，这些金属氧化物对复杂基体中的磷酸化肽段富集具有良好的选择性。但是，大多数金属氧化物的亲水性低，在一定程度上限制了其对磷酸化肽段的净化富集效果，因此，对金属氧化物进行改性已成为近年来的研究热点[23-24]。

铁酸镍为二元金属氧化物，其分子中含有的Ni—O 和Fe—O 功能基团簇均可选择性地与磷酸化肽段结合[25-26]，因此可用作生物样品中磷酸化肽段的富集材料。同时， NiFe2O4 分子中含有铁氧体，是一种磁性物质，在磁铁存在下，可从溶液中快速分离出来[27]。然而，在非修饰的情况下， NiFe2O4 作为富集材料对磷酸化肽段的吸附性能不佳[25-26]，并且极易发生聚集，因而使用不便，影响富集效果[28]。