定量核磁共振氢谱法测定肺炎球菌荚膜多糖中C多糖杂质的含量

摘要 建立了核磁共振氢谱（1H NMR）法测定肺炎球菌荚膜多糖中C 多糖杂质（C-polysaccharide， C-Ps）含量的方法。通过二维1H-15N 异核多键相关（HMBC）谱确定δH 3.24 为C-Ps 的特征峰。以3 种血清型肺炎球菌荚膜多糖6A、6B 和10A 为样品、二甲基亚砜为内标物，建立了C-Ps 绝对定量分析方法，并进行了方法学验证。结果表明， C-Ps 浓度在2.5～198 μg/mL 范围内线性关系良好（R2gt;0.999），检测方法的定量限为2.5 μg/mL；加标回收率在102%～109%之间；重复性相对标准偏差（RSD）小于3%， 5 d 内稳定性RSD 小于1%。本分析方法操作简单，重复性和普适性良好，可作为肺炎球菌荚膜多糖研发和生产中C-Ps 杂质的检测方法，为质检控制提供了新方法和新思路。

关键词 定量核磁共振氢谱；肺炎球菌荚膜多糖；C多糖杂质；磷酸胆碱；质量控制

肺炎球菌是引起全球不同年龄人群，尤其是幼儿和老年人肺炎、中耳炎、支气管炎、脑膜炎和败血症等严重疾病的重要病原菌，其中，侵袭性肺炎球菌疾病具有很高的致死率[1-2]。肺炎球菌荚膜多糖是肺炎球菌细胞壁外荚膜的主要组成成分，具有免疫原性，可在人体内诱导产生特异性抗体，阻止肺炎球菌的感染。目前，接种以肺炎球菌荚膜多糖为主要抗原成分的疫苗是预防肺炎球菌性疾病的有效措施[3-4]。根据荚膜多糖组成结构的不同，已鉴别出96 种不同血清型肺炎球菌。针对成人使用的23 价肺炎球菌荚膜多糖疫苗由常见的致病率高的23 种血清型肺炎球菌的荚膜多糖组成。

目前，肺炎球菌荚膜多糖主要通过不同肺炎球菌菌株进行发酵生产纯化制备。肺炎球菌的C 多糖（C-polysaccharide， C-Ps）是所有肺炎球菌共有的细胞壁组成成分，经由核糖醇磷酸二酯键与荚膜多糖及细胞壁肽聚糖相连。C-Ps 由重复的五糖单元组成，其分子结构和大小与肺炎球菌荚膜多糖类似。因此，在肺炎球菌荚膜多糖的生产纯化过程中很难将C-Ps 完全去除[5]，甚至可能会含有大量的C-Ps。C-Ps 具有高度的免疫原性，但是C-Ps 抗体并不具有保护性[6]。当使用蒽酮硫酸这类显色方法对肺炎球菌荚膜多糖进行含量测定时，并不能区分肺炎球菌荚膜多糖与C-Ps 的显色差别，给准确评价有效抗原含量带来困难。C-Ps 在肺炎球菌荚膜多糖疫苗生产中被视为杂质项，世界卫生组织（WHO）目前也将C-Ps 列为肺炎球菌荚膜多糖疫苗的杂质[7]。因此， C-Ps 杂质的定性和定量检测在肺炎球菌荚膜多糖疫苗研发和生产过程中具有重要意义。

C-Ps 是由β-D-葡萄糖（A）、2-氮乙酰-4-氨基-2，4，6-三脱氧-α-D-半乳糖（B）、2-氮乙酰-2-脱氧-α-D-半乳糖（C）、2-氮乙酰-2-脱氧-β-D-半乳糖（D）和磷酸核糖醇（E）五糖重复单元组成，重复单元间由磷酸二酯键连接。C-Ps 区别于肺炎球菌荚膜多糖最主要的特征是在重复单元的C、D 单糖残基6 位上含有磷酸胆碱基团（Phosphocholine， P-Cho）。磷酸胆碱基团主要以两种取代方式存在[8]，一种是仅在C 单糖残基上的单取代，另一种是在C、D 单糖残基上的双取代（见图1）。

目前，关于C-Ps 定量检测方法的文献报道很少，在实际的研发和生产过程中，多采用离子色谱法和酶联免疫吸附分析（ELISA）法。其中， HPAEC-PAD 离子色谱法利用C-Ps 中存在的核糖醇片段（E），采用酸对C-Ps 进行多次水解，然后检测水解产物中核糖醇的含量，以此间接计算C-Ps 的含量。该方法前处理复杂，而且6A、6B 和10A 这3 种血清型荚膜多糖结构中本身也含有核糖醇片段，因此无法准确检测C-Ps含量[5，9]。此外，还有研究者采用C-Ps 单克隆抗体，利用速率比浊法检测C-Ps 含量[10]；或者采用ELISA法，利用抗体与抗原的特异性结合检测C-Ps 含量。这两种生物学方法都存在检测时间长、成本高、专一性和重复性差等问题。