基于黏性末端链置换扩增的电化学发光/电化学比率传感器用于miRNA检测

摘要 基于黏性末端链置换（TMSD）非酶扩增技术构建了一种简单、高灵敏的电化学发光/电化学比率传感方法用于miRNA 的检测。本方法以修饰在电极上的亚甲基蓝（MB）产生的EC 信号作为内参比信号，并将Ru（phen）32+嵌入到通过分支杂交链式反应（bHCR）产生的DNA 纳米微粒中作为ECL 探针。目标物存在时，MB 脱离电极表面并使ECL 信标修饰在电极上，从而使EC 信号减弱， ECL 信号增强，采用ECL 和EC 信号比值（ECL/EC）作为输出信号，降低了潜在干扰，提高了传感器的重现性和灵敏度。体系的ECL/EC 比值与miRNA-21 的浓度在10 fmol/L～500 pmol/L 范围内具有良好的响应，检出限为6.5 fmol/L。与单一使用ECL 信号的方法相比，在测定1 pmol/L 的miRNA 目标物时，响应信号的相对标准偏差从8.2%下降到4.1%。本方法成功应用于复杂细胞样品中miRNA-21 的检测。

关键词 电化学；电化学发光；比率传感器；黏性末端链置换；miRNA

液体活检作为体外诊断方法的重要分支，在临床中的应用日趋成熟，可用于肿瘤的早期诊断以及治疗效果的动态监测与预后判断[1-3]。miRNA 是临床检测中的重要的标志物，经典的miRNA 检测方法为逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-qPCR），具有良好的灵敏度[4]，然而其操作步骤相对繁琐，并且需要严格精确的控温设备以及专业的操作人员，限制了其在临床中的广泛应用[5]。因此，开发灵敏度高、可靠且简单方便的miRNA 检测技术在肿瘤分子诊断方面具有重要的意义。

电化学发光（Electrochemiluminescence， ECL）具有高信噪比、高灵敏度、设备简单以及操作简便等优势[6-7]，广泛应用于疾病标志物的分析检测，将ECL 与信号放大技术相结合的传感器展现出极高的检测灵敏度[8-9]。传统的ECL 核酸生物传感器的构建通常需在电极表面修饰DNA 探针，因此，传感器的重现性受到传感界面的有效面积、DNA 探针的分布和密度、电极界面的性质以及相关试剂用量等因素的影响[10]。比率传感器通过利用内部或外部参比信号校正，能有效消除非特异性干扰所引起的信号偏差，进而提高传感器的重现性[11-12]。Zhu 等[13]将ECL 信号与电化学（Electrochemistry， EC）信号的比值作为读出信号，制备了一种高精度、高重复性的比率生物传感器，用于miRNA-133a 的超灵敏检测。其中，亚甲基蓝（MB）的EC 信号与目标物miRNA 的浓度无关，仅用于监测电极表面的实时状态，以此校正信号干扰。该传感器具有良好的分析性能，对急性心肌梗塞（AMI）的早期诊断具有良好的应用潜力。

本研究基于一种典型的非酶依赖且不需精确控温的核酸扩增技术—黏性末端链置换扩增（Toeholdmediatedstrand displacement， TMSD）技术[14-15]，构建了一种简单、灵敏和重现性良好的电化学发光/电化学比率传感器用于miRNA 检测。此传感器采用电极上修饰的MB 产生的EC 信号作为内部参比信号，以校正电极表面探针修饰的不均匀性；以MB 修饰的DNA 作为EC 探针，并将Ru（phen）32+ 嵌入到通过分支杂交链式反应（Branched hybridization chain reaction， bHCR）产生的DNA 纳米微粒中作为ECL 探针。目标物存在时， EC 信号减弱， ECL 信号增强， ECL 和EC 信号比值（ECL/EC）与目标物浓度具有相关性。采用ECL/EC 信号比值作为输出信号，可以减少干扰、提高传感器的灵敏度和重现性。TMSD 作为一种非酶信号放大技术，可以有效地放大目标信号，同时避免了酶基方法易受环境变化影响的问题。