抗生素复合纤维膜用于抗菌药物敏感性检测

摘要 高效、快速的药物敏感性检测方法可以更精准地指导临床用药和提高新型抗菌药物的研发效率。传统的抗菌药物敏感性实验（Antimicrobial susceptibility testing， AST）操作简单、结果可靠、特异性强，但存在耗时长的缺点。CCK8 法是基于2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2， 4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐可被细菌细胞的脱氢酶还原形成水溶性橙黄色甲臜，而活菌浓度与甲臜在450 nm 处的吸光度成正比的原理实现活菌数量的检测。本研究以抗生素/培养基复合纤维膜为培养基质，采用CCK8 法检测细菌在此基质上繁殖生长过程中活菌数量的差异，实现了简单、快速、高通量的抗菌药物敏感性检测，总检测时间在8 h 之内。以创口模拟液中的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和人工尿液中的大肠埃希菌为模拟实际样本，评估了本方法在临床应用上的可行性。结果表明，本方法对药物敏感性的评价结果与传统纸片扩散法具有良好的一致性。本方法为药物敏感性检测提供了新的思路，有助于指导临床用药和新型抗菌药物的研发。

关键词 抗生素复合纤维膜；比色法；抗菌药物；敏感性检测；快速检测

抗生素可以通过破坏细菌细胞的完整性或抑制其生长和分裂过程（如细胞壁、蛋白质和核酸的合成）降低细菌的活力，达到抑制细菌活性或杀死细菌的目的，从而抑制细菌感染。抗生素在人类疾病、动物养殖和农业生产的细菌感染控制过程中发挥了重要作用[1]。但是，抗生素的不合理使用以及过量使用将导致“超级细菌”[2]的出现，引发严重的公共卫生问题[3]。据世界贸易组织（WTO）预测，到2050 年，将会有1000 万人死于细菌抗生素耐药性，并且会造成约100 万亿美元的损失[4]。目前，有很多抗菌方法和策略可以控制细菌的感染，包括消毒剂[5]、激光和光动力疗法[6]、金属纳米材料和水凝胶抗菌表面涂层等[7-9]。体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（Antimicrobial susceptibility testing， AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验[10]。药敏试验结果对精准制定感染控制策略、防止药物滥用以及药物开发和研究都具有重要的意义。

传统药物敏感性检测方法包括纸片扩散法、肉汤稀释法和琼脂稀释法等[11]。这些传统方法具有良好的准确性和可靠性，能够用于确定抑制细菌繁殖的最低药物浓度，即抗生素的最低抑菌浓度（Minimuminhibitory concentration， MIC），但是耗时较长（一般需要20～72 h）、灵敏性较低[12]。为了解决上述问题，多种新型药物敏感性检测方法相继被开发出来，如聚合酶链式反应（PCR）[13]、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）[14]、微流控技术[15]、表面增强拉曼光谱（SERS）技术[16]和环介导等温扩增（LAMP）[17]等，相比之下，这些方法检测的灵敏度和效率高，检测时间显著缩短，但是所需要的设备比较昂贵，需要专业技术人员操作[18-19]，并且尚未见相关方法在临床治疗应用中的报道。因此，建立一种低成本、操作简单、快速的药物敏感性检测方法至关重要。

CCK8 法检测活菌数量是基于其中的2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2， 4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（WST-8）可被细菌细胞中的脱氢酶还原形成水溶性橙黄色甲臜，而活菌浓度与甲臜在450 nm 处的吸光度值成正比[20]，基于此实现活菌数量的检测。CCK8 比色法在检测材料抗菌性能和细胞活性[21-22]等方面应用广泛。本研究组[20]曾报道了一种CCK8 显色检测活菌浓度的方法，该方法具有操作简单、显色时间短和灵敏度高等优点，检出限为102 CFU/mL。

本研究基于CCK8 法比色原理，以抗生素/培养基复合纤维膜为培养基质，通过细菌繁殖生长过程中活菌数量的差异即吸光度的差值，建立了一种检测抗菌药物敏感性的方法，用于快速确定细菌对抗菌药物的敏感性。以抗生素/培养基复合纤维膜为培养基质，滴加细菌悬浮液于培养基质上，于37 ℃培养6 h后，加入CCK8 溶液继续孵育2 h， 使用酶标仪测量甲臜在450 nm 处的吸光度，通过吸光度的差值检测细菌对药物的敏感性。本方法具有设备成本低、操作简单、快速（细菌增殖时间6 h，显色时间2 h，总检测时间包含细菌增殖时间和显色时间不超过8 h）等优点。本方法对药物敏感性的评价结果与传统纸片扩散法结果具有良好的一致性，在指导临床用药和新型抗菌药物研发方面具有潜在的应用价值。